Universidade Federal Do Amapá

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAPÁ PRÓ-REITORIA DE ENSINO E GRADUAÇÃO COORDENAÇÃO DO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS TÉCNICAS DE BIOTECNLOGIA E BIOLOGIA MOLECULAR MACAPÁ-AP 2013 1 Alex Frank Nº. Matricula: Jackeline Vilhena Nº. Matricula: 201119009 Joandro Pandilha dos Santos Nº. Matricula: 201119029 Melissa Figueira de Almeida Nº. Matricula: 20111030006 TÉCNICAS DE BIOTECNLOGIA E BIOLOGIA MOLECULAR Trabalho entregue como requisito para a 2º avaliação parcial da disciplina de Biotecnologia ministrada pelo professor Dr. Moacir Bento. MACAPÀ-AP 2013 2 INTRODUÇÂO O avanço da ciência e tecnologia teve um aumento significativo desde meados da década de 80, quando surgiram técnicas fundamentadas na análise do ácido desoxirribonucleico (DNA), tornando-se uma das principais técnicas de identificação humana e investigações criminais. Esse avanço tanto da ciência quanto da tecnologia proporcionaram o surgimento de dois ramos da biologia tão inovadores e promissores em suas determinadas especificações: Biotecnologia e Biologia Molecular. As biotecnologias em seu sentido mais amplo compreendem a manipulação de micro-organismos, plantas e animais, objetivando a obtenção de processos e produtos de interesse. Desta maneira, toda atividade que envolva a aplicação dos conhecimentos de fisiologia, bioquímica e genética, é considerada como técnica biotecnológica. Em seu senso mais restrito as biotecnologias estão associadas ao emprego das técnicas modernas de biologia molecular e celular (GUERRA & RO NODARI, 2006). Outros conceitos de biotecnologias: a) a utilização de sistemas celulares para a obtenção de produtos e desenvolvimento de processos (CNPq); b) a aplicação dos princípios científicos e de engenharia para o processamento de materiais por agentes biológicos proporcionando produtos ou serviços (FAO, 1989); c) o uso das técnicas de regeneração in vitro e do DNA recombinante (Fernandes, 1987). A biologia molecular é um estudo a nível molecular, onde seu foco principal é o estudo das estruturas e funções do material genético, assim como seu produto de expressão as proteínas. Essa área ainda busca entender as interações entre os diversos sistemas nucleares, onde se inclui a relação entre DNA, RNA e síntese de proteínas. 3 SUMÁRIO INTRODUÇÃO 3 TECNICAS DE BIOTECNOLOGIA 5 CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS 5 CLONAGEM 6 TRANSGÊNICOS 7 TERAPIA GÊNICA 8 TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR 9 CLONAGEM MOLECULAR 10 PCR (Reação Polimerase em Cadeia) 11 ELETROFORESE 13 VETORES (PLASMIDIOS) 13 MARCADORES MOLECULARES 14 SOUTHERN BLOTTING 15 NORTHERN BLOTTING 15 WESTWRN BLOTTING 15 CONCLUSÃO 17 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS 18 4 TECNICAS DE BIOTECNOLOGIA Biotecnologia é o conjunto de conhecimentos que permite a utilização de agentes biológicos (organismos, células, organelas, moléculas) para obter bens ou assegurar serviços. A biotecnologia tem como principais técnicas: cultura de tecidos vegetais, clonagem, transgênicos, terapia gênica. 1. CULTURA DE TECIDOS VEGETAIS Baseia-se na capacidade que a planta tem de dar origem a uma nova planta, a partir de qualquer parte dela, por meio da ativação e da repressão de genes. Isto se chama totipotência celular (GUERRA & RO NODARI, 2006). A cultura de tecidos vegetais tem como principais utilidades: obter plantas livres de doenças; multiplicar rapidamente um grande número de plantas; obter híbridos que não podem ser obtidos pela polinização natural; fundir células de origens diferentes; preservar banco de germoplasma; obter plantas haploides, ou seja, com metade do número de cromossomos da espécie; obter variantes somaclonais, que são plantas que sofrem mutações espontâneas, entre outras finalidades. A cultura de vegetais foi criada com varias expectativas, e ganharam varias formas de aplicações que serão relatadas a abaixo.  Cruzamentos Amplos A ampliação da base genética para o melhoramento de plantas pode envolver cruzamentos interespecíficos e intergenéricos. Por exemplo, Atylosia, um gênero taxonomicamente próximo à Cajanus, apresenta espécies com características desejáveis, como resistência a moléstias e insetos e tolerância à salinidade e seca. Algumas espécies de Atylosia hibridizam com Cajanus, enquanto que outras não. Mesmo após cruzamentos bem sucedidos, ocorrem barreiras de pós-fertilização, como o não desenvolvimento do endosperma e a subsequente degeneração do embrião híbrido. Nestes casos, o resgate e a cultura de embriões pode facilitar a obtenção de híbridos viáveis. Além de permitir uma nova fonte de variabilidade genética, a hibridização ampla tem se mostrado como técnica promissora para a produção de plantas haploides via eliminação seletiva de cromossomos, sendo conhecida como 5 ‘técnica bulbosum’. Assim, quando Hordeum vulgare é empregada como mãe em cruzamentos com H. bulbosum, após a polinização e fertilização, o embrião resultante pode ser haplóide uma vez que o conjunto cromossômico de H. bulbosum pode ser seletivamente eliminado.  Embriogênese Somática Células vegetais são consideradas totipotentes uma vez que possuem o potencial de regenerar uma planta completa. O padrão ideal de produção de plantas a partir de células simples é por meio da embriogênese somática, onde, as células são objeto de mudanças de estrutura e organização, similares àquelas que ocorrem durante a embriogênese zigótica. Embriões somáticos são produzidos em um grande número de espécies, mas ainda não há segurança quanto à estabilidade genética e uniformidade fenotípica das plantas regeneradas por esta técnica. A embriogênese somática tem sido a técnica empregada como sistema regenerativo preferencial para a transformação genética. 2. CLONAGEM A palavra clone, do grego klon, significa broto e foi cunhada em 1903 pelo botânico H.J. Webber (Safire, 1997). Seu significado é qualquer grupo de células ou organismos produzidos assexuadamente de um único ancestral sexuadamente produzido. Formalmente, mamíferos podem ser clonados pela fissão de embriões (produção artificial de gêmeos) ou por transferência nuclear, isto é, transferência de núcleos de células somáticas (derivadas de qualquer célula diploide de um embrião, feto, criança ou adulto) para ovócitos sem núcleo para produzir embriões reconstituídos que são capazes, após a transferência para hospedeiros adequados, de se desenvolver em uma prole viável (Wolf et al., 1998). É a produção de indivíduos geneticamente iguais. Consiste em um processo de reprodução assexuada, que resulta na obtenção de cópias geneticamente idênticas de um mesmo ser vivo - microrganismo, vegetal ou animal. Resumidamente, os passos individuais no procedimento de transferência nuclear incluem:  Preparação de um ovócito enucleado (citoplasto).  Isolamento da célula doadora ou do núcleo doador. 6  Ativação do citoplasto.  Fusão celular para produzir um embrião reconstituído.  Cultura do embrião.  Transferência do embrião para um útero hospedeiro. Ilustração das etapas existentes na clonagem, (Figura 1) (GUERRA & RO NODARI,2006). Figura 1. 3. TRANSGÊNICOS Os Organismos Geneticamente Modificados (OGMs) ou transgênicos são aqueles que tiveram genes estranhos, de qualquer outro ser vivo, inseridos em seu código genético. 7 O processo consiste na transferência de um ou mais genes responsáveis por determinada característica de um organismo para outro, ao qual se pretende incorporar esta característica. Processo existente na criação de um organismo transgênico, (Figura 2) (GUERRA & RO NODARI, 2006). Figura 2. 4. TERAPIA GÊNICA É a inserção de genes nas células e tecidos de um indivíduo para o tratamento de uma doença, em especial, doenças hereditárias. A terapia genética visa a suplementar com alelos funcionais aqueles que são 8 defeituosos. A figura abaixo demonstrará o esquema de terapia gênica. (Figura 3) (GUERRA & RO NODARI, 2006). Figura 3. TECNICAS DE BIOLOGIA MOLECULAR A biologia molecular uma área inovadora que busca sempre o aprimoramento e o controle de técnicas capazes de desvendar as interações que ocorrem em nosso corpo a nível celular e molecular. As principais técnicas criadas até hoje na área da biologia molecular são de clonagem molecular; PCR (reação de polimerase em cadeia); eletroforese; plasmídeos; marcadores moleculares; Northern blotting, Southern blotting, Western blotting. 9 1. CLONAGEM MOLECULAR A clonagem molecular consiste na difusão de moléculas de DNA idênticas e baseia-se na propagação natural de células ou indivíduos geneticamente idênticos ao inicial. O experimento de clonagem gênica consiste em introduzir o gene dentro de células bacterianas e isolá-las em colônias. As células de cada colônia são idênticas entre si (NASCIMENTO et al., 1999). A clonagem gênica consiste em duas etapas básicas: a) Na primeira etapa faz-se a ligação entre um fragmento de DNA, chamado inserto, contendo o gene de interesse com outra molécula de DNA, o vetor, para formar uma quimera ou molécula de DNA recombinante (figura 4) (BROWN, 2003). Fig. 4. Ligação do vetor com o inserto para formar a molécula de DNA recombinante. b) Na segunda etapa, a molécula de DNA recombinante é transportada para dentro de uma célula hospedeira, em geral uma bactéria, ocorrendo o processo de transformação. A célula que recebeu o DNA recombinante é chamada de célula transformada, a qual sofre muitos ciclos de divisão, produzindo várias cópias do DNA recombinante, como pode ser visto na Figura 6 (BROWN, 2003). 10 Fig. 5. Transformação de uma célula bacteriana com uma construção de DNA recombinante . 2. PCR (reação polimerase em cadeia) A reação em cadeia da polimerase (PCR) é um procedimento rápido que possibilita a amplificação in vitro de fragmentos de DNA específicos, partindose de uma quantidade mínima de DNA alvo ou de RNA previamente convertido em cDNA. Para a aplicação da técnica, são necessários três segmentos de ácidos nucléicos: a dupla fita de DNA para servir de molde e a construção de dois oligonucleotídeos (primers) específicos - de fitas simples e complementares as duas fitas molde de DNA -, desenhados de modo a flanquear a seqüência a ser amplificada. Além disso, são necessários DNA polimerase, dNTPs, tampão e sais (MgCl). A técnica consiste de ciclos repetitivos; cada ciclo está dividido nos passos apresentados na Figura 3 (AUSUBEL, et al., 2003; WEAVER, 2001). 1º passo (94-96ºC) - Desnaturação do DNA a alta temperatura, devido ao rompimento das pontes de hidrogênio que unem as duas fitas. 2º passo (30-60ºC) - Anelamento dos primers em posições específicas (essa temperatura é definida em função da sequência nucleotídica dos primers). 3º passo (72-75ºC) - Extensão da sequência a ser amplificada pela ação da DNA polimerase. 11 Durante cada ciclo, as fitas complementares de DNA são copiadas pela extensão dos primers que se anelam em posições opostas. Desta forma, cada fita de DNA recém amplificada é usada como molde no ciclo seguinte, resultando assim, no acúmulo exponencial do fragmento de DNA flanqueado pelos dois primers (Figura 6) (Embrapa). Fig. 6. Etapas da PCR – Reação em Cadeia da Polimerase. Fig. 7. Esquema de amplificação exponencial de um gene por PCR (Embrapa). 12 3. ELETROFORESE A eletroforese em gel de agarose é um método simples e eficiente que permite separação, identificação e purificação de moléculas de DNA. As moléculas são separadas através da migração de partículas no gel, com a aplicação de uma diferença de potencial elétrico, onde as moléculas de menor massa migram mais rápido. O protocolo padrão de gel de agarose permite separar fragmentos de DNA entre 0,5 a 25 kb. A eletroforese também pode ser utilizada para separar proteínas e moléculas de RNA. A agarose utilizada no gel é um polissacarídeo que forma uma rede e permite regular a velocidade da migração das moléculas durante a separação. A adição de corante fluorescente (brometo de etídio ou sybr®), que se intercala entre as bases do DNA, e o uso de radiação ultravioleta permitem a visualização e a fotografia, conforme Figura 9 (NASCIMENTO et al.,1999; SOUZA, 2003). Fig. 8. - Eletroforese de fragmentos de PCR amplificados; (M - marcador de peso molecular). 4. PLASMÍDEOS OU VETORES Os plasmídeos são moléculas de DNA fita duplas extracromossomal encontrados em todas as espécies de bactérias. Os plasmídeos variam em estrutura, tamanho, modo de replicação, número de cópias por célula e habilidade para propagarem-se em diferentes bactérias. Todos contêm três características comuns: marca seletiva, origem de replicação e sítio múltiplo de clonagem (NASCIMENTO, 1999). A marca seletiva refere-se a genes que conferem resistência a antibióticos e que proporcionam a seleção dos clones transformados daqueles não transformados. Para essa seleção, é adicionado ao meio de cultura o antibiótico adequado, em concentrações que permitam 13 diferenciar a célula não transformada (sensível ao antibiótico) da célula transformada (resistente ao antibiótico). A origem de replicação autônoma ou ori é o sítio em que se inicia a replicação do DNA, podendo se replicar independentemente da replicação bacteriana e produzir milhares de cópias do plasmídeo dentro da célula hospedeira. A replicação dos plasmídeos pode ser sincronizada com o ciclo celular, resultando em baixo número de cópias, ou ser independente do ciclo da célula hospedeira, permitindo a proliferação de centenas de cópias por célula. O sítio múltiplo de clonagem ou polylinker é um sítio de clivagem de endonucleases de restrição no qual é inserido um fragmento de DNA de interesse sem interferir na funcionalidade do plasmídeo (BROWN, 2003; WEAVER, 2001). 1. MARCADORES MOLECULARES São quaisquer características, processos bioquímicos ou fragmentos de DNA, os quais permitem a distinção de indivíduos geneticamente diferentes. O teste de paternidade, utilizando DNA, é um exemplo clássico da aplicação da biologia molecular na biotecnologia. As técnicas de biologia molecular requerem a utilização de aparelhos específicos para aumentar a quantidade de DNA necessário para verificar diferenças entre indivíduos. Este aparelho é o termociclador, responsável pelas reações de PCR (reação em cadeia da polimerase). É por meio da PCR que se amplifica a quantidade de DNA do material biológico, (Figura 9) (GUERRA & RO NODARI, 2006). 14 Figura 9. Os marcadores moleculares podem auxiliar em: detecção de mutações; identificação de doenças; isolamento de genes; teste de paternidade; proteção de variedades; estimativa da distância genética entre os parentais para a predição da heterose; facilitar a seleção; análise de caracteres quantitativos; estudos filogenéticos; seleção de genitores. 5. NORTHEN BLOTTING, SOURTHEN BLOTTING, WESTERN BLOTTING As técnicas de blotting baseiam-se nas propriedades de hibridização das moléculas de ácidos nucléicos. Algumas técnicas foram criadas propondo-se localizar a posição de um gene em uma molécula de DNA. Para a análise de DNA, utiliza-se a técnica de Southern blotting. Primeiramente, o DNA é digerido com uma ou mais enzimas de restrição e separado em uma eletroforese em gel de agarose. Os fragmentos de DNA fita dupla são desnaturados in situ e transferidos para uma membrana de nylon ou nitrocelulose, na qual são imobilizados no mesmo padrão de bandeamento do gel. A imobilização é realizada com radiação UV, para as membranas de nylon, e calor, para as membranas de nitrocelulose. A membrana é colocada sobre o gel e um tampão 15 de alta concentração salina é adicionado e, por capilaridade, passa através do gel, promovendo a transferência dos fragmentos de DNA para a membrana. A membrana resultante é uma réplica do gel de agarose. Sondas de RNA ou DNA marcadas com radioatividade são utilizadas, a hibridização com o DNA fixo na membrana ocorre e uma autorradiografia revela qual fragmento de restrição contém o gene clonado, conforme pode ser visto na Figura 10 (AUSUBEL et al., 2003; HARWOOD, 1996; WEAVER, 2001). Fig. 10. Southern blotting. Um fragmento de DNA específico pode ser identificado separando a mistura de fragmentos por eletroforese, transferindo para a membrana e hibridizando a sequência com uma sonda molecular complementar e marcada com 32P Para a análise de RNA, a técnica, que é análoga ao Southern blotting, recebeu o nome de Northern blotting. Um RNA extraído é submetido à eletroforese em gel de agarose, transferido para uma membrana e hibridizado com sondas radioativas de RNA ou DNA. Esta técnica permite identificar em qual tecido ou tipo celular um determinado gene é expresso. Para um experimento de Northern blotting, alguns cuidados para manter as soluções e os materiais do experimento livres de RNases devem ser adotados até a transferência do RNA para a membrana (HARWOOD, 1996; KYAN, 2003). Western blotting era um pesquisador que buscava entender o processo que envolvia as proteínas e que utilidades proteínas especificas teriam em determinados processos do DNA. 16 CONCLUSÃO A biotecnologia assim como a biologia molecular são áreas que trabalham em caminhos bem próximos, e sempre buscando reduzir a distancia de uma pra outra através de técnicas com princípios próximos, um exemplo disso é a técnica de marcadores moleculares, que é de grande importância na biologia molecular e de muita utilidade na biotecnologia, o principal obstáculo de áreas tão inovadoras como essas, é quando suas ideias e pretensões esbarram nas leis de código penal e leis da bioéticas. 17 REFERENCIAS BIBLIOGRAFICOS AUSUBEL, F. M.; BRENT, R.; KINGSTON, R. E.; MOORE, D. D.; SEIDMAN, J.G.; SMITH, J.A.; STRUHL, K. Current protocols in molecular biology, New York: John Wiley, 2003. 4755 p. BROWN, T. A. Clonagem gênica e análise de DNA. Porto Alegre: Artmed, 2003. 376 p. GUERRA & RO NODARI. Apostila de Biotecnologia—CCA/UFSC—MP. Edição da STEINMACHER (2006). HARWOOD, A. J. Basic DNA and RNA protocols. London: Human Press, 1996. 528 p. KYAN, C. M. Northern blot: detecção de RNA por hibridização em membranas. In: AZEVEDO, M. O.; FELIPE, M. S. S.; BRÍGIDO, M. M.; MARANHÃO, A. Q.; SOUZA, M. T. de. Técnicas básicas em biologia molecular. Brasília, DF: Universidade de Brasília, 2003. 211 p. NASCIMENTO, A. A. C.; ESPREAFICO, E. M.; LARSON, M. L. P.; MONESI, N.; ROSSI, N. M. M.; RODRIGUES, V. Tecnologia do DNA recombinante. Ribeirão Preto: Universidade de São Paulo, 1999. 85 p. Apostila. Safire W (1997) Clone Clone Clone Clone. New York Times, April 6, 1997. Wolf DP, Meng L, Ely JJ, Stouffer RL (1998). Recent progress in mammalian cloning. J Assist Reprod Genet. 15: 235-9. SOUZA, M. T. de. Técnicas básicas em biologia molecular. Brasília, DF: Universidade de Brasília, 2003. 211 p. WEAVER, R. F. Molecular biology. Lawrence: University of Kansas, 2001. 880 p. 18