Seminário Ms

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Esquema de fragmentação quercetina (7) (flavonol) 73 45 44 43 42 (R)-(-)-mevalonolactona 46 47 48 52 51 Ciclioglicilprolina 50 m/z 58 49 Tirosol 41 40 39 Introdução Estudos apontam o fungo Alternaria euphorbiicola como grande promessa para controle herbicida por ter sido encontrado em inflorescência de necroses, ferrugem e cancros nas hastes de Euphorbia heterophylla. Euphorbia heterophylla é considerada erva daninha em muitos países tropicais e subtropicais, por ser responsável por grandes perdas na agricultura, como em culturas de soja e milho. Estudos mostraram que a aplicação de suspensões de esporos do fungo Alternaria euphorbiicola em algumas plantas causou o surgimento de necroses depois de 24 h, o que sugere que tais fungos são capazes de produzir metabólitos fitotóxicos que causam danos a essas plantas hospedeiras. 31 Artigo 2 30 Conclusão HS-SPME acoplada a GC-MS é uma técnica rápida e um método simples que permite a extração e a identificação de compostos voláteis responsáveis pelo aroma típico dos frutos de Evodia. A importância da fibra adequada para extração que depende da natureza dos compostos alvo. Estudo dos efeitos da variação dos parâmetros na HS-SPME. Monoterpenos e sesquiterpenos são responsáveis pelo aroma característico dos frutos. Os perfis qualitativos de compostos voláteis de E. rutaecarpa e E. officinalis são similares, variando somente a abundancia relativa dos compostos. 29 Não houve contaminação ou decomposição da fibra por SPME, pois nenhum pico apareceu na corrida de recondicionamento da fibra. O aroma típico dos frutos de Evodia podem ser atribuídos às grandes quantidades de monoterpenos e sesquiterpenos. O pico de número 30 identificado como 2,6-ditert-butil-4-hidroxitolueno (BHT) é um antioxidante sintético bem conhecido adicionado a plásticos, elastômeros, solventes e itens alimentícios. Daí sugere-se que este seja apenas um contaminante advindo da fibra ou algum material da coluna e não um metabólito secundário dos frutos de Evodia. 28 Testar a atividade fitotóxica do extrato de fungos Alternaria euphorbiicola, isolar e identificar os metabólitos presentes em tal extrato. Objetivos 32 Os fungos Alternaria euphorbiicola foram colhidos de plantas E. heterophylla infectadas e cultivados por 7 dias em condições apropriadas. O extrato obtido foi fracionado por CC em sílica gel 60 (Macharel-Nagel, 0,04-0,063 mm) e as frações com atividade confirmada foram novamente fracionadas por CC e CCD, o que permitiu o isolamento e posterior identificação por técnicas espectroscópicas e espectrométrica de quatro metabólitos: anidromevalonolactona (1), tirosol (2), (R)-(-)-mevalonolactona (3) e cicloglicilprolina (4). Metodologia 33 Foram obtidos espectros: No IV por ATR-FT; De RMN de 1H e 13C a (300 e 75 MHz, respectivamente) em CD3OD; Massas por EI (70 eV). As temperaturas de fusão foram também determinadas. Determinação da rotação ótica do composto 3. As identidades dos metabólitos foram confirmados por: espectros da literatura; espectros obtidos a partir dos compostos sintéticos. Os compostos sintéticos 2 e 3 foram comprados (Sigma Aldrich) e 1 e 4 foram sintetizados por metodologias conhecidas. 34 38 37 Resultados Anidromevalonolactona 36 Teste da folha pulverizada: Folhas saudáveis de plantas jovens foram pulverizadas com as diferentes frações do extrato fúngico para identificar a atividade fitotóxica das mesmas e avaliadas diariamente, sendo as plantas mantidas sob condições apropriadas. Teste da folha furada: A folha de plantas jovens saudáveis fora furadas (2 furos por folha) com uma agulha e gotas (10 uL) das respectivas frações que apresentaram atividade fitotóxica foram aplicadas nos furos. Os compostos isolados também foram submetidos a tal teste, sendo diluídos em DMSO (por não apresentar atividade fitotóxica). 35 53 Ensaio da folha furada 54 Ao contrário da (R)-(-)-mevalonolactona (3), não se havia conhecimento do isolamento da anidromevalonolactona (1) de fungos. Por isso, foi considerado a possibilidade da formação da anidromevalonolactona a partir da desidratação da (R)-(-)-mevalonolactona, pelo fato de que o meio de cultura de fungos ser ácido (pH = 5,6). Solução aquosa 3mg mL-1 de (3) foi preparada em pH 5,6 e foi monitorada em intervalos de 0, 12, 24, 48 e 72 h por GC-MS. Foi possível perceber que nenhuma decomposição de (3) nem mesmo formação de (1) foi detectada, permitindo inferir a não formação de (1) a partir da desidratação ácida de (3) no meio de cultura de fungos e ainda, que (1) é sim um metabólito de A. euphorbiicola. - H2O (3) (1) H+ 55 A espectrometria de massas no estudo de produtos naturais pode ter funções diferenciadas: método auxiliar na identificação de compostos, quando se tem certa previsão dos compostos a serem identificados; técnica auxiliar como base para comparação de dados da literatura, quando não se tem qualquer conhecimento da estrutura dos componentes a serem elucidados; técnica altamente eficaz de identificação de compostos quando se conhece a estrutura de compostos a serem identificados. Considerações finais 81 A perda de C2H2O do íon quasimolecular é devido à quebra no anel C seguida de nova ciclização envolvendo o anel B. A possibilidade de envolvimento com o anel A foi descartada pelos dados obtidos para 3',4'-dihidroxiflavona que também apresentou perda de C2H2O mesmo não contendo grupos OH no anel A. A fragmentação RDA gerando 1,3A- tem respostas diferente para ESI nos modos positivo e negativo: no primeiro (+) esse fragmento sofre a perda de CO2 e no segundo (-), há a perda de CO do íon 1,3A-. Diferenciação de flavonas: apigenina (2) e genisteína (2') que são isômeros possuem mesmas características de fragmentação exceto na formação do íon 1,3A- onde não ocorre em 2'. Já para o primeiro isômero, tal íon possui ainda vários íons produtos, o que permite a distinção dos dois isômeros. O espectro de genkwanina exibe somente o íon [M-H-CH3]- como íon produto. A intensidade de fragmentação está relacionada com o grau de hidroxilação do anel B, principalmente, o que pode ser estendido a outros flavonóides agliconas. Fragmentações caraterísticas de flavonas 71 Fragmentações caraterísticas de flavonas As flavonas apresentam perdas neutras de CO e CO2 que podem ser atribuídas ao anel C (com exceção da genkwanina (3) que perde somente um radical CH3.). A perda de CO no anel C pode ser comprovada pela presença de picos [M-H-CO]- nos compostos 5 e 6 que não possuem hidroxilas (ou são deficientes) ligadas aos anéis A e/ou B. A perda de CO no anel C pode ser seguida de perda de CO2 envolvendo o anel A, o que é comprovado pela perda também de CO e CO2 dos compostos 2' e 4 que possuem grupos hidroxilas no anel A mas não no B. A perda de CO2 do íon [M-1]- resulta na contração do anel C que pode ser comprovado da perda de CO2 pelo composto 5 que só possui um único grupo hidroxila no anel A. Tal perda de CO2 pode ser seguida de perda de CO ou CO2 pelo anel A, comprovado pela presença do íon [M-H-88]- no composto 4 que possui OH somente no anel A. 70 luteonina (1) (flavona) Esquema de fragmentação 69 O uso de MS-ESI-Ion Trap permitiu a investigação de alguns caminhos de fragmentações e a inferência sobre a especifidade estrutural de flavonóides agliconas. As informações estruturais obtidas podem ser importantes do ponto de vista de triagem fitoquímica. A análise fitoquímica no modo negativo deveria ser mais seletivo e sensível que o modo positivo. Além disso, alguns íons RDA observados no modo positivo e úteis na determinação estrutural dos anéis A e B estiveram ausentes no modo negativo, mostrando a complementariedade destas técnicas no estudo de flavonóides agliconas por espectrometria de massas. Conclusão 80 Outras fragmentações do composto 14 são quase todas semelhantes às apresentadas anteriormente à luteolina (1) e também revelam perdas de CO, C2H2O, CO2 e C3O2 a partir de [M-H]-. Isso permite inferir que os sítios envolvidos em ambas fragmentações devem ser os mesmos para os dois tipos de flavonóides, sendo localizados nos anéis A e C. Somente para os compostos 12 e 14, há ainda a formação do ânion em m/z 125, atribuído a 1,4A-. Tal fragmento é considerado diagnóstico para a presença de dois grupos OH no anel A de flavan-3-óis mas não é observado para os tipos de flavonóides apresentados neste trabalho. Fragmentações caraterísticas de flavanonas 79 A fragmentação da flavanona (15) mostrou somente o íon [M-H-CO]- como pico base, produto do íon quasimolecular [M-H]-, não havendo nenhuma outra fragmentação. Eriodictiol (12) e naringenina (13) renderam íons 1,3A- como picos base com outros poucos fragmentos RDA. O composto 14 perde inicialmente um radical CH3. a partir do íon quasimolecular que sequencialmente, sofre retrociclização envolvendo as ligações 0 e 4 do anel C, formando o íon –CH30,4B.- que perde adicionalmente duas moléculas de CO. Fragmentações caraterísticas de flavanonas 78 As perdas de CO ou CO2 a partir do íon quasimolecular são explicados do mesmo modo como nas flavonas. Já a consecutiva perda de CO2 ou CO a partir desses íons produtos , respectivamente, levam à formação de um íon estabilizado por sua estrutura de ressonância. Essas perdas de CO e CO2 consecutivas para formação de um íon estabilizado por ressonância se dá pelo anel C e é confirmado pelo fato de que fisetina (8), que possui somente uma OH no anel A, e galengina (10) que não possui substituintes no anel B, também possui esse perfil de fragmentação. O flavonol metoxilado 11 não apresentou o íon quasimolecular [M-H]-, porém com uso de MS3 foi possível identificar o ânion radical [M-H-CH3]-. O padrão de fragmentação deste flavonol foi semelhante ao composto 9, excetuando-se para o íon 1,3A-, que é o pico base para 11 e possui baixa intensidade para 9, o que permite diferenciá-los. Fragmentações caraterísticas de flavonóis 74 Para quercetina (7) e fisetina (8) (e somente para esses flavonóis) os picos bases são dados por 1,2A-, diferentemente de 11 que apresenta 1,3A- como pico base. O íon 1,2A- sofre perda de CO e de CO2 sequencialmente, para ambos 7 e 8, tendo a diferença de 16 u, referente a ausência de um átomo de oxigênio no último. Fragmentações caraterísticas de flavonóis 75 76 Esquema de fragmentação isosakurametina (14) (flavanona) 77 68 Nomenclatura adotada para as clivagens no anel C 67 66 Introdução Flavonóides compõem uma classe de substâncias consideradas pigmentos naturais, e que são compostos fenólicos que diferem entre si pela sua estrutura química e características particulares. Podem ser encontrados frutas, vegetais, grãos, flores, folhas, chá e vinho, entre outros. São importantes por serem considerados responsáveis pela princípio ativo de muitas plantas medicinais. Possuem atribuição de potenciais antioxidante, anti-inflamatório, anticarcinogênico, antimutagênico, antidepressivo, entre outros. 59 Artigo 3 58 Possibilidade do isolamento e identificação de quatro metabólitos fitotóxicos de fungos A. euphorbiicola, utilizando-se os métodos de separação e espectroscópicas (e espectrométricas) descritas. Inferência da fitotoxicidade seletiva da ciclioglicilprolina à erva daninha Ipomoea grandifolia. Devido a similaridade do efeito fitotóxico produzido pelos metábólitos isolados e da suspensão de fungos A. euphorbiicola, sugere-se a participação destes compostos no processo de invasão dos tecidos da planta hospedeira pelos fungos. Conclusão 57 Teste da folha furada em outras ervas daninhas 56 A necessidade de se estudar tal classe de produtos naturais levou ao desenvolvimento substancial de técnicas de separação e identificação como LC-MS e GC-MS. Dentre as várias técnicas de ionização em MS está ESI que fornece menor quantidade de fragmentos. O modo negativo neste tipo de ionização tem mostrado resultados mais seletivos e mais sensíveis em LC-MS na análise de flavonóis. O uso do analisador Ion Trap e da técnica MSn permite investigar os caminhos de fragmentação para se obter informações estruturais de diversos tipos de compostos. 60 Objetivos Propor esquemas de fragmentação em triagem fitoquímica de flavonóis em plantas com uso de HPLC acoplada a ESI-Ion Trap-MSn permitindo a caracterização de flavonas, flavonóis e flavanonas. 61 Metodologia Foi feita análise de 11 tipos de flavonóis naturais por LC-MS a partir de um extrato cr. Foram utilizados 5 padrões sintéticos de flavonóides para análise e determinação estrutural. Os compostos foram separados por HPLC utilizando-se uma C18 de 25 cm, 4,5 mm d.i., 5 um utilizando-se diferentes gradientes de metanol e ácido fórmico por 70 min. Os espectros de massas foram obtidos por ESI - Ion trap e dissociação por colisão induzida (CID) para espectros MS/MS. 62 Resultados Foram analisados um total de 11 flavonóides naturais dentre eles: 4 flavonas; 4 flavonóis; 4 flavanonas. Além disso, foram obtidos os espectros de massas de mais 4 compostos sintéticos de estruturas similares para obtenção de um perfil de fragmentação. 63 Isômero de (2) 64 Cromatograma obtido do extrato com os 11 flavonóides separados e identificados. 65 72 27 Sabe-se que o aumento da temperatura aumenta a concentração de compostos voláteis em headspace. Contudo, a SPME é um processo exotérmico e o aumento da temperatura diminui então a extração destes compostos. As altas temperaturas aumentaram as respostas o que poderia sugerir um aumento de compostos menos voláteis no headspace que compensa a diminuição da adsorção induzida por essas altas temperaturas. Não foi detectada nenhuma decomposição dos compostos aromáticos a altas temperaturas. As melhores condições, dentro das faixas estudadas: Text = 80 °C text = 18 min teq = 25 min 25 Artigo 1 8 Introdução Os frutos maduros de Evodia rutaecarpa contém em sua composição vários alcalóides, ácidos carboxílicos, flavonóides e óleo essencial. Vários efeitos farmacológicos: atividades antimalárica, antioxidante, antimicrobiana, anti-inflamatória, anti-obesidade, etc. Apresentaram inibição de proliferação e migração de células cancerígenas. 9 Vários estudos na determinação de alcaloides de Evodia por HPLC e EC. Estudos dos compostos voláteis destes frutos ainda são escassos. A caracterização dos compostos aromáticos destas plantas poderiam ser um apontador útil da identidade e qualidade dos frutos. O método mais comum para obtenção de óleos essenciais de plantas aromáticas tem sido a hidro destilação ou destilação por arraste a vapor, embora exija grandes quantidades de amostra, longo tempo de extração e ocorrência de degradação de alguns compostos. Técnica alternativa é a SPME, que oferece extração rápidas, simples, sem necessidade de solventes. 10 Combinar a HS-SPME com GC-MS para determinação dos compostos voláteis de E. rutaecarpa e E. officinalis Escolha de fibra micro extratora de maior eficiência; Otimização das condições de extração: temperatura de extração, tempo de extração e tempo de equilíbrio; Determinação dos índices de Kovats; Comparação com MS de padrões e enriquecimento de amostra. Objetivo 11 Artigos: "Headspace solid-phase microextraction-gas chromatrography-mass spectrometry analysis of the volatile compounds of Evodia species fruits" "Phytotoxic effects of metabolites from Alternaria euphorbiicola against its host plant Euphorbia heterophylla" "Determination of flavone, flavonol and flavanone aglycones by negative ion Liquid Chromatograhy eletrospray ion trap mass spectrometry" 7 Isopreno Terpenos 6 Fenóis 5 A espectrometria de massas aplicada a estudos de produtos naturais Discentes: Fernando Oliveira Welton Rosa Sumário Introdução Produtos Naturais: composição Classificação de alguns tipos de produtos naturais Estrutura, metabolismo e propriedades Identificação de compostos GC-MS e Índice de Kovats CC e CCD e técnicas espectroscópicas e espectrométricas (IV, RMN, MS) MS-ESI-Ion Trap e MSn 2 INTRODUÇÃO Produto natural é todo composto químico produzido por um ser vivo, seja animal, vegetal, fungo, bactéria ou protozoário. Metabólitos primários: responsáveis pela manutenção da vida do ser em estudo (crescimento, desenvolvimento e reprodução). Carboidratos, lipídeos, aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos. Metabólitos secundários: não resulta na morte imediata, porém, a longo prazo afeta a sobrevivência, fecundidade ou estética do organismo, podendo mesmo não ter qualquer impacto significativo. Alcalóides, fenóis, terpenos, flavonóides, etc. 3 Alcalóides 4 Metodologia Material vegetal foi coletado e condicionado às extrações e análises. Realização de uma hidro destilação para comparação com SPME: 40 g de material vegetal 300 mL de água destilada 5h Triagem para escolha da fibra micro extratora de maior eficiência: polidimetilsiloxano (PDMS) (1 cm); polidimetilsiloxano-divinilbenzeno (PDMS-DVB) (1 cm); divinilbenzeno-carboxeno-polidimetilsiloxane (DVB-CAR-PDMS); (2 cm) carbowax-divinilbenzeno (CW-DVB) (1 cm). 12 26 Análise em GC-MS: Coluna capilar Rtx – 5 MS Crossbond 5% difenil – 95% dimetil polisiloxano 30 m de comprimento 0,25 mm d.i. Programação de temperatura: 50 °C por 2 min 8 °C.min-1 temperatura final: 280 °C por 2 min. Injeção modo splitless Gás de arraste: hélio a 13 psi 14 Triagem para escolha da fibra extratora de maior eficiência: Extração por headspace nas mesmas condições Eficiência foi baseada nas áreas dos picos, considerando-se o tamanho das fibras. 21 Otimização da HS-SPME: Variáveis avaliadas: temperatura de extração; tempo de equilíbrio; tempo de extração. Avalição baseada na soma das áreas dos picos dos compostos extraídos em cada análise. As áreas variam diretamente de acordo com as condições de extração, mas não o número de picos. 22 23 24 Métodos de extração: A extração de compostos voláteis por hidro destilação apresentou eficiência mais baixa que SPME. A água utilizada, bem como a alta temperatura causam perda e/ou degradação de alguns compostos além de demandar maior tempo de extração. Foram obtidos 0,01 mL / 40 g (baixo rendimento) e não foi possível o estudo completo da composição do óleo e portanto a técnica utilizada na análise foi SPME. Resultados 20 Micro extração: 0,5 g de material vegetal inserido em recipiente hermeticamente fechado banho termostático com a temperatura desejada Condições para escolha da fibra de micro extração: 60 °C tempo de equilíbrio: 30 min tempo de extração: 15 min tempo de dessorção: 1 min a 250 °C recondicionamento da fibra: 5 min a 250°C 13 18 Temperaturas: Injetor: 250 °C Fonte de ionização: 160 °C Ionização por EI (70 eV) Faixa de massas: 40-400 m/z Mistura de hidrocarbonetos alifáticos (C8-C25) foram injetadas em GC-MS utilizando-se SPME nas mesmas condições. Identificação feita comparando-se os tempos de retenção dos picos cromatográficos de compostos autênticos (padrões) e por comparação dos índices de retenção de Kovats com os da literatura. A confirmação foi baseada na comparação dos espectros de massa obtidos dos compostos puros. 15 Bibliotecas Referências 19 Obtém-se então o cromatograma da amostra e os índices de retenção de cada componente. 17 Como é calculado o índice de Kovats? Faz-se inicialmente uma corrida cromatográfica em GC-MS de uma mistura de padrões de hidrocarbonetos alifáticos, nas mesmas condições que serão realizadas as análises com a amostra. 16 Clique para editar o título mestre 29/11/2013 nº 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível Clique para editar o texto mestre 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o texto mestre Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível Clique para editar o texto mestre Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o estilo do subtítulo mestre 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o texto mestre 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível 29/11/2013 nº Clique para editar o título mestre Clique para editar o texto mestre 29/11/2013 nº 1 29/11/2013 Clique para editar o texto mestre Segundo nível Terceiro nível Quarto nível Quinto nível nº