Relatorio De Bioquimica-espectrofotometria

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FATECI - CURSOS TÉCNICOS CURSO DE ANÁLISES CLÍNICAS DISCIPLINA: BIOQUÍMICA PRÁTICA: ESPECTROFOTOMETRIA PROFº: ANDRÉ LUIS ALUNOS: FCO FLÁVIO DA SILVA LOPES, MARIA KELLY ROCHA DA SILVA, TELLIN DINO NOGUEIRA VIEIRA, LINTELMA NOGUEIRA VIEIRA RELATÓRIO DE PRÁTICAS FORTALEZA, 10 DE NOVEMBRO DE 2016 Espectrofotometria Introdução A espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigações biológicas e fisico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância. Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível. A água absorve fortemente na região do infravermelho. A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem das estruturas das moléculas, e é característica para cada substância química. Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida (absorbância): a energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das substâncias se deve a absorção (transmitância) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos. A fotometria é o ramo da óptica que se preocupa em medir a luz, em termos de como seu brilho é percebido pelo olho humano. Aquela se diferencia da radiometria, que é a ciência que mede a luz em termos de sua potência absoluta, por descrever a potência radiante associada a um dado comprimento de onda usando a função de luminosidade modeladora da sensibilidade do olho humano ao brilho. A fotometria também é utilizada na astronomia, na observação de estrelas, pela percepção da diminuição da luz por elas emitida. Através de estudos e cálculos, é possível descobrir novos planetas e saber informações como rotação, translação, distância da estrela e satélites. A Figura 9 mostra um esquema de um espectrofotômetro, com os seus principais componentes numerados de 1 a 5, sendo 1 - fonte, 2 - prisma para seleção do l, 3 - fenda, 4 – cubeta com a amostra e 5 - detector produzindo o resultado final. Os espectrofotômetros modernos geralmente utilizam feixes duplos produzidos através de espelhos semitransparentes, sendo que um feixe passa através da amostra enquanto o outro feixe não, e a comparação entre a intensidade destes dois feixes produz a leitura final do equipamento. Isto elimina problemas como flutuações na fonte, diferente detecção para diferentes ls, etc. Objetivos: Conhecer e aplicar as técnicas que utiliza o aparelho de espectrofotômetro. Prática 01 - Creatinina PRINCÍPIO A creatinina e outros componentes do soro reagem com a solução de picrato em meio alcalino, formando um complexo de cor vermelha que é medido fotometricamente. A adição de um acidificante abaixa o pH para 5,0, promovendo a decomposição do picrato de creatinina, permanecendo inalterada a cor derivada dos cromogênios, que também é medida fotometricamente. A diferença entre as duas leituras fornece o valor da creatinina. AMOSTRAS Soro ou plasma (heparina, EDTA, fluoreto, oxalato, citrato), Urina (colhida em intervalo de 24 horas), Líquido amniótico. EQUIPAMENTOS Espectrofotômetro Centrífuga Banho - maria mantido à temperatura constante (37 ºC). Pipetas para medir amostras e reagentes. Cronômetro. Kit de Creatinina Labtest. REAGENTES UTILIZADOS (nº 1): Ácido pícrico: Armazenar entre 15 – 25 ºC. Contém ácido pícrico 44,4 mmol/L. (nº 2): Tampão: Armazenar entre 15 – 25 ºC. Contém hidróxido de sódio 208 mmol/L, tetraborato de sódio 12,7 mmol/L e surfactante. (nº 3): Padrão 4,0 mg/dL: Armazenar entre 15 – 25 ºC. Após o manuseio, sugere-se armazenar bem vedado para evitar evaporação. (nº 4): Acidificante: Armazenar entre 15 – 25 ºC. Contém ácido acético 11,4 mol/L. PROCEDIMENTO Coletou-se 10 ml de sangue no tubo a vácuo e em seguida centrifugou-se a amostra por 5 minutos para obter o soro. Misturou-se 0,5 mL de soro a 1,0 mL de Ácido Pícrico (nº 1), em seguida agitou-se e centrifugou-se durante 10 minutos. Pegou-se 3 tubos de ensaio e proceder conforme a tabela a seguir: Branco Teste Padrão Tampão (nº 2) 2,0 mL 2,0 mL 2,0 mL Sobrenadante ----- 0,75 mL ----- Água destilada ou deionizada 0,25 mL ----- ----- Padrão (nº 3) ----- ----- 0,25 mL Ácido pícrico (nº 1) 0,5 mL ----- 0,5 mL Misturou-se e colocou-se as amostras em banho-maria a 37 ºC durante 10 minutos. (O nível da água no banho estava superior ao nível dos reagentes nos tubos de ensaio). Determinou-se as absorbâncias do teste e padrão em 510 nm filtro verde (500 a 540 nm), acertando o zero com o branco. A absorbância do teste foi o A1. Acidificante (nº 4) 0,1 mL 0,1 mL ----- Misturou-se e deixou-se na temperatura ambiente durante 5 minutos. Determinou-se a absorbância do teste em 510 nm ou filtro verde (500 a 540 nm), acertando o zero com o branco. A absorbância do teste foi o A2. RESULTADO Resultados não obtidos por motivo de problemas no aparelho de espectrofotômetro. Prática 02 - AST/TGO PRINCÍPIO A determinação das transaminases por métodos enzimáticos combina a elevada especificidade de ação das enzimas com simplicidade operacional envolvida. No presente método, a AST catalisa a transferência do grupo amino do aspartato para o α-cetoglutarato com formação de glutamato e oxalacetato. Este, sob a ação da Desidrogenase málica (MDH), é convertido em malato. Simultaneamente, o NADH presente é oxidado a NAD. A velocidade de diminuição da concentração de NADH o meio pode ser seguida espectrofotometricamente em 340 nm, sendo proporcional à concentração de AST na amostra. O sistema contém também a enzima desidrogenase láctica, visando a eliminação da interferência de cetoácidos endógenos. AMOSTRAS Soro ou plasma (heparina, EDTA). EQUIPAMENTOS Espectrofotômetro Centrífuga Banho - Maria mantido à temperatura constante (37 ºC). Pipetas para medir amostras e reagentes. Cronômetro. Água destilada Kit de AST/TGO KATAL. REAGENTES UTILIZADOS (nº 1): Tampão: Contém L-alanina 500 mmol/L, aspartato desidrogenase 600 U/L, lactato desidrogenase 1.200 U/L e azida sódica 0,1 g/L. (nº 2): Reagente Enzimático: NADH 0,18 mmol/L, α-cetoglutarato 15 mmol/L, e azida sódica 15,5 mmol/L. PROCEDIMENTO Coletou-se 10 ml de sangue no tubo a vácuo e em seguida centrifugou-se a amostra por 5 minutos para obtenção do soro. Pegou-se um tubo de ensaio e adicionou-se 4 partes do conteúdo do frasco de Tampão (1) com 1 parte do conteúdo do frasco de Reagente Enzimático (2) e homogeneizou-se bem para formar o reagente de trabalho. Acertou-se o zero do aparelho de espectrofotometria com água destilada. Pegou-se um tubo de ensaio e adicionou-se 1,0 mL de Reagente Trabalho, em seguida equilibrou-se a 37ºC durante 2 minutos. Adicionou-se 0,1 mL de amostra (soro) e homogeneizou-se rapidamente. Transferiu-se para uma cubeta termostatizada na temperatura de trabalho e aguardou-se 90 segundos. Efetuo-se a leitura inicial de absorbância me 340, disparando simultaneamente o cronômetro. Efetuo-se novas leituras após1, 2 e 3 minutos com o aparelho previamente zerado contra água destilada. RESULTADO Resultados não obtidos por motivo de problemas no aparelho de espectrofotômetro.