Relatório De Aulas Práticas De Bioquímica

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FURB – FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BLUMENAU CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA Acadêmico: Antônio Guarrilha Junior Monira Pioli Talita Grahl Victor Henrique lucas Disciplina: Bioquimica Curso: Odontologia - I semestre Professora: Ana L. B. Zeni Relatório de Aulas Práticas SUMÁRIO 1. pH e indicadores...................................................... ..........pag.04 1. Introdução....................................................... ..................pag.04 2. Materiais e métodos.........................................................p ag.04 3. Resultados e discussões.................................................pag.05 4. Conclusões....................................................... .................pag.07 2. Carboidratos...................................................... .................pag.09 1. Introdução....................................................... ..................pag.09 2. Materiais e métodos.........................................................p ag.10 3. Resultados e discussões................................................pag.11 4. Conclusões....................................................... ................pag.14 3. Lipídios.......................................................... ......................pag.15 1. Introdução....................................................... ...................pag.15 2. Materiais e métodos.......................................................... pag.15 3. Resultados e discussões.................................................pag.16 4. Conclusões....................................................... .................pag.18 4. Proteínas......................................................... ....................pag.19 1. Introdução........................................................ ...................pag.19 2. Materiais e métodos.......................................................... pag.19 3. Resultados e discussões..................................................pag.2 0 4. Conclusões....................................................... ..................pag.23 5. Aminoácidos....................................................... ................pag.24 1. Introdução....................................................... ...................pag.24 2. Materiais e métodos.......................................................... pag.25 3. Resultados e discussões..................................................pag.2 5 4. Conclusões....................................................... ..................pag.26 6. Enzimas........................................................... ....................pag.27 1. Introdução....................................................... ...................pag.27 2. Materiais e métodos.......................................................... pag.27 3. Resultados e discussões..................................................pag.2 8 4. Conclusões....................................................... ..................pag.30 Referências......................................................... ......................pag.31 1. pH E INDICADORES 1. INTRODUÇÃO O Potencial Hidrogeniônico (pH) consiste num índice que indica a acidez, neutralidade ou alcalinidade de um meio qualquer. As substâncias em geral, podem ser caracterizadas pelo seu valor de pH, sendo que este é determinado pela concentração de íons de Hidrogênio (H+). Quanto menor o pH de uma substância, maior a concentração de íons H+ e menor a concentração de íons OH-. "o pH de uma solução aquosa pode ser medido aproximadamente usando-se vários corantes indicadores como, litmus, fenolftaleína e fenol vermelho, os quais sofrem transformações coloridas sempre que um próton dissocia-se da molécula dos mesmos." (LEHNINGER, NELSON E COX, 1993, pg. 69) Na aula prática de pH e indicadores foram realizados experimentos como objetivo de determinar o pH de amostras mediante uso de indicadores e produzir um indicador a partir do repolho roxo. Relevantes observações notadas nas experiências foram os resultados de acidez e alcalinidade das varias substancias medidas, onde um pH acima de 7 é tido como básico e abaixo de 7 como ácido sendo que a medida 7 representa sua neutralidade. 1.2 MATERIAIS E MÉTODOS Nesta determinada aula prática foi usado diversos materiais, dos quais serão citados a seguir: a) Indicadores: tornassol, fenolftaleína, papel universal, pHmetro e substrato retirado do repolho roxo. b) Soluções: NaOH, HCl, H2O, CH3COOH, NH4OH e uma solução de livre escolha, entre coca – cola, detergente, café, suco de fruta, xampu, chá e amônia, no qual optamos pelo uso da coca – cola. c) Materiais laboratoriais: tubos de ensaio, estante, Becker, folhas de gaze, vidro relógio, fogareiro com bico de buzo, pipeta. Para a execução das experiências foram realizados diversos procedimentos. Em um primeiro momento foi retirada uma pequena porção de repolho roxo, adicionada a um Becker e fervido até liberar a cor. A solução foi posta em repouso por um período de 30 minutos aproximadamente e filtrada em um pedaço de gaze logo após esse período, sendo usado como indicador de pH, onde em soluções ácidas adquiri de coloração vermelha e soluções básicas coloração de azul a verde. Em procedimentos seguintes foram identificados ácidos e bases através do uso de indicadores: I – foram dispostos em vidro relógio pedaços de papel indicador tornassol e papel universal, onde foram gotejadas com auxilio de pipetas as soluções escolhidas. Observou-se a coloração dos papeis para obtenção e registro dos resultados. II – através do indicador líquido fenolftaleína de 2 a 5 gotas adicionadas a 2 ml das soluções em um tubo de ensaio, observou-se a coloração adquirida pelas soluções para registro dos resultado. III – usando o indicador do repolho roxo, foi repetido todo o procedimento anterior. IV – utilizando a Coca-Cola como solução obtivemos o resultado de pH da mesma, através do uso do pHmetro. 1.3 RESULTADOS E DISCUÇÕES Experiência - I "Solução "Coloração do papel "Coloração do papel " " "tornassol "universal " "NaOH "Azul (base) "13 " "HCl "Vermelho (ácido) "0 " "H2O "Vermelho (ácido) "4 " "CH3COOH "Vermelho (ácido) "5 " "NH4OH "Azul (base) "9 " As substancias que obtiveram coloração vermelha no papel tornassol e numeração abaixo de 7 no papel universal (HCl, H2O, CH3COOH), são consideradas com pH ácido por apresentarem maior concentração de ións de hidrogênio H+. Já as substancias que obtiveram coloração azul no papel tornassol e numeração maior que 7 no papel universal (NaOH, NH4OH), são consideradas bases, portanto apresentam maior concentração de OH-. Experiência - II "SOLUCÃO "Coloração da fenolftaleína " "NaOH "Vermelho (8,0 - 10,0) " "HCl "Incolor " "H2O "Incolor " "CH3COOH "Incolor " "NH4OH "Vermelho (8,o – 10,0) " Neste experimento foi usado um indicador, a fenolftaleína, onde sua característica em solução acida é incolor, e em solução básica vermelho (8,0 – 10,0). Desta forma as soluções HCl, H2O e CH3COOH são Básicas, pois o resultado foi Incolor, e as soluções NaOH e NH4OH coloração vermelha, solução acida. Experiência – III "SOLUCÃO "Coloração do repolho roxo " "NaOH "Verde " "HCl "Rosa forte " "H2O "Roxo " "CH3COOH "Rosa " "NH4OH "Verde " Nesta experiência, utilizamos como indicador o repolho roxo. Analisando os resultados dos níveis de acidez, observa-se que as soluções onde a coloração foi verde, era básicas, e as soluções em rosa e rox,o indica um pH mais acido. Experiência - IV "SOLUCAO "Papel Tornassol "Papel Universal " "Coca-cola "Vermelho (Acido) "2 " Observamos que a Coca-cola é uma substancia acida, pois a coloração indicada no papel tornassol vermelho e no papel universal pH 2 indicaram sua acidez. Medimos através do pHmetro as soluções NaOH, HCl, H2O, CH3COOH, NH4OH. "SOLUCAO "pHmetro " "NaOH "12.6 " "HCl "0 " "H2O "4.0 " "CH3 COOH "2.5 " "NH4OH "9.8 " O pHmetro ou medidor de pH é um aparelho usado para medição de pH, mais preciso. Nessas soluções medidas, as acidas foram HCl, H2O e CH3COOH, sendo que o pH foi menor que 7, e as básicas NaOH e NH4OH, pH maior que 7. 1.4 CONCLUSÃO Observando as experiência realizadas, e os resultados em cada uma delas, podemos concluir que a medição de pH sendo através do papel tornassol ou universal observando a coloração destes, ou também com o uso do pHmetro para ter uma medição de forma mais precisa, assim, identificar as soluções acida ou básicas, é importante para a manutenção da vida, como Lehninger, Nelson e Cox (1995), citam que, o pH afeta a estrutura e a atividade das macromoléculas biológicas como, por exemplo, a atividade catalítica das enzimas. O pH também é usado para identificar doenças, através da medição dos níveis de pH do sangue e urina. 2. COLORAÇÃO DE CARBOIDRATOS 2.1. Introdução Os carboidratos são as biomoléculas mais abundantes na natureza, apresentam como fórmula geral: [C(H2O)]n, daí o nome "carboidrato", ou "hidratos de carbono" e são moléculas que desempenham uma ampla variedade de funções, entre elas: fonte de energia, reserva de energia, estrutural e matéria prima para a biossíntese de outras biomoléculas. " Os animais podem sintetizar alguns carboidratos a partir de gorduras e proteínas, porém a maior parte dos carboidratos animais originam-se fundamentalmente, de plantas" (MURRAY, GRANNER, MAYES, RODWELL, 2002, pg. 149) Os carboidratos podem ser classificados em monossacarídeos, dissacarídeos, oligossacarídeos e polissacarídeos. Os monossacarídeos, também chamados de açúcares simples, consistem numa só unidade cetônica. O mais abundante é o açúcar de seis carbonos D- glucose; é o monossacarídeo fundamental de onde muitos são derivados. A D- glucose é o principal combustível para a maioria dos organismos e o monômero primário básico dos polissacarídeos mais abundantes, tais como o amido e a celulose. São carboidratos ditos glicosídeos, pois são formados a partir da ligação de 2 monossacarídeos através de ligações especiais denominadas "Ligações glicosídicas". A ligação glicosídica ocorre entre o carbono anomérico de um monossacarídeo e qualquer outro carbono do monossacarídeo seguinte, através de suas hidroxilas e com a saída de uma molécula de água. São os carboidratos complexos, macromoléculas formadas por milhares de unidades monossacarídicas ligadas entre si por ligações glicosídicas, unidas em longas cadeias lineares ou ramificadas. Os polissacarídeos possuem duas funções biológicas principais, como forma armazenadora de combustível e como elementos estruturais.(Harper, pg,149) Na aula prática de coloração de carboidratos, tivemos como objetivo identificar através de vários reagentes os hidratos de carbono nas substâncias, os hidratos de carbono redutores e desvendar qual a solução problema proposta nas experiências. 2.2. Materiais e métodos Vários materiais foram utilizados nestes experimentos: a) reagentes: solução de hidratos de carbono, reagentes de Molisch (naftol 5% em álcool), ácido sulfúrico concentrado, reagentes de Lugol (5g de iodo + 10g de iodeto de potássio em 10ml de agua), reagente de Benedict e reativos de Barfoed. b) soluções: água, glicose, sacarose, amido, frutose, lactose, matose e uma solução problema. c) vidrarias e instrumentais: tubos de ensaio, estante, fogareiro com bico de buzo, pipetas, conta gotas. Cada experiência teve seus próprios passos e métodos: I. No primeiro momento foi realizada experiência usando-se o reagente de Molisch. Foram preparados 5 tubos com soluções diferentes e acrescentados 2 gotas de reativo de Molisch. No passo seguinte foi agitado os tubos e adicionado 2ml de ácido sulfúrico concentrado em cada tubo, para observar e interpretar os resultados obtidos. II. No segundo experimento foi utilizado o reagente de Lugol. Foram preparados 6 tubos com soluções de agua, glicose, sacarose, amido, pequena fração de algodão com agua e a solução problema, e acrescentado 2 gotas de reagente de Lugol. Foi observado, aquecido, resfriado e novamente observado para podermos obter os resultados positivos nas soluções que continham amido. III. Identificação de hidratos de carbono redutores foi nosso passo seguinte, onde foram preparados 7 tubos de ensaio com água, glicose, frutose, sacarose, amido, lactose e a solução problema. Adicionados aos tubos o reagente de Benedict. Aquecidos por mais ou menos 5 minutos em banho-maria fervente, foram observados e analisados os resultados para carboidratos redutores. IV. Agora fazendo uma reação com Barfoed, para monossacarídeos redutores, foram utilizados 5 tubos com glicose, maltose, amido, água destilada e a solução problema. A 2,5ml do reativo de Barfoed foi adicionado 1ml de cada solução a ser testada. Fervendo durante 1 minuto em banho maria, todas as soluções foram comparadas com a do tubo branco que continha água destilada. Os resultados revelaram os monossacarídeos redutores. V. Em um último experimento fizemos a inversão da sacarose. Em um tubo de ensaio foi pipetado 5ml de solução de sacarose e acrescentado 0,5ml de HCl. Fervido por 2 minutos deixamos reservado. O HCl rompe a ligação glicosídica, assim separamos a glicose e a frutose. Para termos a certeza do rompimento das moléculas em outro tubo de ensaio pipetamos 2ml do reativo de Benedict. Adicionando 0,5ml da sacarose já invertida, fervemos e observamos o aparecimento de um precipitado vermelho-tijolo.( Roteiro de aulas práticas). 2.3 Resultados e discussões Experimento I: Para a reação com o reagente e Molisch tivemos os seguintes resultado: a) Para I ml de água o resultado foi negativo. b) Para I ml de glicose 0,I M, o resultado foi positivo. c) Para I ml de sacarose 0,I M, o resultado foi positivo. d) Para I ml de amido 0,I %, o resultado foi positivo. e) Na solução problema o resultado final também foi positivo. Os ácidos concentrados causa a desidratação de monossacarídeos. As pentoses dão como produto final o furfural, e as hexoses o hidroximetilfurfural. Estes derivados se condensam com o alfa-naftol,  originando produtos coloridos. Se um oligossacarídeo ou polissacarídeo estiver presente, ele é primeiro hidrolisado em seus monossacarídeos constituintes, que são então desidratados. Essa reação é considerada geral para os carboidratos, e não é específica pois se processa com outras substâncias. O surgimento de um anel de coloração lilás estável indica que houve formação de furfurais, revelando a presença de açúcares na amostra. Assim nas soluções onde o resultado foi positivo obteve-se este anel revelando estes açucares.(roteiro de aulas práticas). Experimento II Resultados para reação com Lugol: a) I ml de agua, resultado negativo. b) I ml de glicose 0,I M, resultado negativo. c) I ml de sacarose 0,I M, resultado negativo. d) I ml de amido 0,I %, resultado positivo (coloração azul) e) Solução problema, resultado negativo. f) pequena fração de algodão com I ml de água, resultado negativo. Como o Lugol não reage com monossacarídeos, dissacarídeos e celuloses, nas reações com agua, glicose, sacarose, e também na solução os resultados foram negativos. Na presença do amido a coloração se tornou azul, dando um resultado positivo, sabendo-se que este reagente que é a base de iodo reage com polissacarídeos. Desta maneira obtivemos a primeira resposta para nossa solução problema, onde descobrimos que ao grupo de polissacarídeos ela não pertencia.(roteiro de aulas práticas) Experimento III Resultados na identificação de hidratos de carbono redutores com reagente de Benedict: a) I ml de água, resultado negativo (coloração azul). b) I ml de glicose 0,I M, resultado positivo (coloração telha). c) I ml de frutose 0,I M, resultado positivo (coloração telha). d) I ml de sacarose 0,I M, resultado negativo (coloração azul). e) I ml de amido 0,I%, resultado negativo (coloração azul). f) I ml de lactose 0,I M, resultado positivo ( coloração telha). g) solução problema 1ml, resultado positivo ( coloração telha). Os carboidratos redutores possuem grupos aldeídos ou cetonas livres ou potencialmente livres, sofrendo oxidação em solução alcalina de íons metálicos como o cobre. Os íons cúpricos (Cu++) são reduzidos pela carbonila dos carboidratos a íons cuprosos(Cu+) formando o óxido cuproso, que tem cor vermelho tijolo. (intermed99.vilabol.uol.com.br/bioquimica2.html). O carboidratos redutores são monossacarídeos e somente alguns dissacarídeos. A sacarose que é um dissacarídeo, não sofre oxidação porque possui dois carbonos anoméricos envolvidos na ligação glicosídica. Obtivemos a nossa segunda descoberta referente a solução problema, pois como o resultado foi positivo para a reação dando a coloração telha, agora sabemos que ou ela é um monossacarídeo ou um .(roteiro de aulas praticas). Experimento IV Reação de Barfoed, resultados: a) solução de glicose I%, resultado positivo ( monossacarídeo redutor). b) solução de maltose I%, resultado negativo. c) solução de amido I%, resultado negativo. d) água destilada, resultado negativo. e) solução problema, resultado positivo (monossacarídeo redutor). Este teste foi parecido com o teste anterior. A diferença é que, como o reagente de Barfoed é fracamente ácido apenas os monossacarídeos obtiveram o resultado positivo para açucares redutores. Com esse teste descobrimos o resultado final para nossa solução problema, a qual tendo o resultado positivo ficou claro que ela pertence ao grupo de monossacarídeos redutores. Para adiantar nossa experiência nos foi dito qual era a solução. Assim ficamos sabendo que a solução era de frutose.(roteiro de aulas praticas). Experimento V Inversão da sacarose, resultados: a) quando adicionamos HCl a sacarose obtivemos o rompimento da ligação glicosídica. Assim a glicose e a frutose ficaram separadas. b) no segundo passo, adicionamos à solução de sacarose já invertida o reagente de Benedict, o qual obtivemos resultado positivo para açucares redutores, pois a frutose e a glicose separadas são monossacarídeos, assim nossa coloração com o reagente de Benedict fico cor telha. A sacarose por si só não é um açúcar redutor, pois possui dois carbonos anoméricos em sua ligação glicosídica. Quando através do HCl, rompemos essa ligação, obtivemos a glicose e a frutose separadas as quais, desta forma são açucares redutores. 2.4 Conclusões Ao término de todas nossas experiências, podemos concluir que obtivemos os resultados desejados no início. Conseguimos através do Molisch identificar a presença de carboidratos nas substâncias, com o Lugol identificar a presença de amido, com o Benedict os açucares redutores (mono e dissacarídeos), com o Barfoed os monossacarídeos redutores, e ao final obtivemos a inversão da sacarose através da adição de HCl na mesma. Esta aula prática facilitou em grande escala o entendimento sobre monossacarídeos, dissacarídeos e polissacarídeos, seus tipos de ligação, e as reduções oxidativas nos açucares. Todos os experimentos ocorreram de uma forma tranquila, sem grandes problemas, onde conseguimos fazer os testes uma vez só, sem repetições. 3 LIPÍDIOS 3.1 Introdução Os lipídios, também chamados de gorduras, são biomoléculas orgânicas compostas, principalmente, por moléculas de hidrogênio, oxigênio, carbono. Fazem parte ainda da composição dos lipídios outros elementos como, por exemplo, o fósforo. Os lipídios possuem a característica de serem insolúveis na água. Porém, são solúveis nos solventes orgânicos (álcool, éter, benzina, etc). " Os lipídios são constituintes importantes da dieta não só pelos seus elevados valores energéticos mas também pelas vitaminas lipossolúveis e ácidos graxos essenciais contidos na gordura dos alimentos naturais". (MURRAY, GRANNER, MAYES, RODWELL, 2002, pg. 160) Os lipídios possuem várias funções como isolantes elétricos, valores energéticos, composição de algumas membranas celulares, isolantes térmicos e facilitação de algumas reações químicas no organismo como: hormônios sexuais, vitaminas lipossolúveis (vitaminas A, K, D e E) e as prostaglandinas. Segundo Mayes (ibid, pg. 160), os lipídios são classificados em simples, que seriam as gorduras e as ceras, e os complexos, que são os fosfolipídios, glicolipídios, sulfolipídios e os aminolipídios. A aula prática de lipídios teve como objetivo, observar a solubilidade dos lipídios, observar a formação de sabões e por último, observar métodos qualitativos de caracterização de lipídios importantes para os organismos vivos. 3.2 Materiais e métodos Os materiais usados nos testes foram: a) reagentes: lecitina, clorofórmio, água, reativo de Hübl, etanol e NaOh b) soluções: ácido oléico, ácido esteárico. c) vidrarias e instrumentais: tubos de ensaio, espátula, conta gotas, fogareiro com bico de buzo e algodão. Métodos utilizados: I. no teste de solubilidade foram adicionados a 2 tubos de ensaio uma ponta de espátula de lecitina. No tubo nº 1 foi adicionado água e no tubo nº 2 adicionamos clorofórmio. Observando e analisando os tubos anotamos a solubilidade ou não de cada substância testada. II. no segundo teste, fizemos a diferenciação entre ácidos graxos saturados e insaturados onde distribuímos os reagentes em 4 tubos. Um tubo com clorofórmio, outro com ácido oléico, outro com ácido esteárico e outro com lecitina e clorofórmio. A seguir, adicionamos aos 4 tubos, uma gota de reativo de Hübl, onde agitamos e observamos as reações, assim prosseguimos adicionando sempre uma gota até que chegasse a marca de 5 gotas, onde obtivemos os resultados de saturações e insaturações. III. no último teste fizemos a saponificação de ácidos graxos. Em um tubo de ensaio que já continha 1 espátula de lipídio, acrescentamos 2 ml de NaOH 10N, e 10 ml de etanol absoluto. Fechamos o tubo com algodão e misturamos bem as soluções. O próximo passo foi botar em banho maria, fervente onde agitamos ocasionalmente até a formação de uma pasta. Depois de todo este processo obtivemos o produto desejado da saponificação.(Roteiro de aulas práticas) 3.3 Resultados e discussões Experimento I "Reagente "TUBO 1 "TUBO 2 " "Lecitina "1 ponta de espátula "1 ponta de espátula " "Clorofórmio "---- "2 ml " "Água "2 ml "---- " a) no teste com o tubo nº1, a lecitina não solubilizou com a água. b) no teste com o tubo nº2, a lecitina solubilizou com o clorofórmio. Os lipídios devido a sua natureza apolar são geralmente insolúveis em água solúveis em solventes apolares. Neste experimente podemos concluir esta afirmação com os resultados obtidos acima.(roteiro de aula prática). Experimento II "SOLUÇÕES "TUBO 1 "TUBO 2 "TUBO 3 "TUBO 4 "RESULTADOS " "Padrão de "2ml "---- "---- "1,5 ml "Saturado " "cor " " " " " " "(clorofórmi" " " " " " "o) " " " " " " "Sol. Ácido "---- "2ml "---- "---- "Insaturado " "oléico " " " " " " "Sol. Ácido "---- "---- "2ml "---- "Saturado " "esteárico " " " " " " " Lecitina "---- "---- "---- "0,5ml "Insaturado " Os ácidos graxos insaturados adicionam o iodo as ligações duplas tornando-se saturados. O vermelho róseo que se observa no tubo que contém somente clorofórmio é a cor característica das soluções em que o iodo se encontra na forma livre. Na experiência notamos que as soluções onde se perde a cor e o tom de rosa fica cada vez mais fraco, são as soluções ditas insaturadas, que foi o caso do ácido oléico e da lecitina. No ácido esteárico e no clorofórmio por manter a cor forte, determinou-se soluções saturadas. Este teste foi feito com o reativo de Hübl, que tem por característica tons de rosa forte para saturados e tons fracos para insaturados.( Roteiro de aulas práticas) Experimento III Neste experimento obtivemos os seguintes resultados: Com os lipídios complexos hidrolisados em meio alcalino no processo de saponificação obtivemos a separação do glicerol do ácido graxo, onde o glicerol é a parte liquida e o ácido graxo a pasta de sabão obtida. 3.4 Conclusões Podemos concluir no final dos testes que os ácidos graxos na sua maioria são insolúveis em água, e podem ser saturados ou não. No final descobrimos o que acontece no "mistério" da saponificação, onde nossos avós faziam e nós olhávamos e não entendíamos o que acontecia. Hoje temos a explicação cientifica deste processo que se chama hidrolise de lipídeos complexos em meio alcalino. Os resultados que obtivemos foram os esperados e tudo ocorreu de forma tranquila. Foram experimentos rápidos, realizados em uma hora mais ou menos. Concluímos que os lipídios são muito importantes para a energia das nossas células entre outras funções, e também que são eles os grandes responsáveis por as pessoas engordarem, sendo armazenados em nosso tecido adiposo. 4. CARACTERIZAÇÃO DE PROTEÍNAS 4.1 INTRODUÇÃO As são compostos orgânicos de alto peso molecular, formadas pelo encadeamento de aminoácidos. Representam cerca do 70% do peso seco da célula sendo, portanto, o composto orgânico mais abundante de matéria viva. Tem papel também na nossa informação genética, expressa como proteínas. "Para cada proteína existe um segmento de DNA (um gene) que guarda a informação, especificando sua sequência de aminoácidos" (LEHNINGER, NELSON, COX , 1995, pg. 99) O Objetivo da aula prática de caracterização de proteínas, foi o de realizar diversos experimentos com a finalidade de se observar a desnaturação das proteínas através de diversos métodos, sendo eles por ação do calor, por ação de ácidos e álcalis fortes, por reação com metais pesados, por reação com reagentes alcalóides ou por ação de solventes orgânicos. 4.2 MATERIAIS E MÉTODOS Na execução destes experimentos foram usados os seguintes materiais: d) Proteína: albumina bovina. e) Soluções reagentes: HCl (ácido clorídrico) concentrado, NaOH 12N (hidróxo de sódio), solução diluída de CuSO4(sulfato de cobre) a 0,5%, solução diluída de FeCl3(percloreto férrico) a 0,5%, solução diluída de acetato de chumbo a 1%, solução diluída de ácido pícrico a 0,25%, solução de ácido tricloroacético a 10%, acetona e butanol. f) Materiais laboratoriais: tubos de ensaio, estante, pipeta, bico de Bunsen. O método aplicado para a obtenção dos devidos resultados se deu por meio de atividades práticas. A primeira atividade organizada foi a de observação da desnaturação de 2 ml da solução da proteína pela ação do calor, aquecendo-a diretamente na chama. A segunda, por reação de ácidos e álcalis fortes, foi realizada com a adição de 2 ml de solução de albumina bovina, cuidadosamente, em um tubo de ensaio contendo HCl concentrado e em um segundo tudo contendo NaOH 12N. Em uma terceira prática, por reação de metais pesados, foram preparados 3 tubos de ensaio contendo 2 ml de solução de albumina bovina em cada um. No primeiro tubo, foi gotejado solução diluída de CuSO4(sulfato de cobre) a 0,5% até ocorrer a precipitação. No segundo tubo, foi realizado o mesmo procedimento, porém, com a solução diluída de FeCl3(percloreto férrico) a 0,5%. E no terceiro tubo o procedimento se deu da mesma maneira anterior, no entanto, com a solução diluída de acetato de chumbo a 1%. Na quarta prática a desnaturção foi dada por reagentes alcalóides, com o preparo de 2 tubos de ensaio contendo 2 ml de solução de albumina bovina. Adicionando ao primeiro tubo, por meio de gotejamento lento, solução de ácido píprico a 0,25%, e ao segundo tubo, foi realizado de mesma maneira, no entanto, com a solução de ácido tricloroacético a 10%, ambos até que um excesso de reagente seja adicionado. A quinta e última atividade foi realizada para a observação da desnaturação por ação de solventes orgânicos, onde foi adicionado a um primeiro tubo 2 ml de acetona, e a outro tudo 2 ml de butanol e logo após acrescentado 2 ml de solução de albumina bovina e homogenizado cada um dos tubos, observando a intensidade de precipitação de cada tubo. 4.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES Experiência – I Com a experiência obtivemos a formação de um coágulo branco no fundo do tubo de ensaio, formado por proteína desnaturada. Essa desnaturação se dá pela quebra das diversas ligações que existem na proteína, podendo ser das ligações iônicas, pontes de hidrogênio dentre outras existentes nas estruturas secundárias, terciárias ou quaternárias. "As proteínas possuem uma estrutura tridimensional (conformação) bem definida, da qual dependem fundamentalmente suas propriedades físicas, químicas e biológicas. Essa estrutura é relativamente sensível à ação do calor, que causa desorganização das cadeias peptídicas, com conseqüente alteração conformacional. Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e altera as estruturas quaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar sua estrutura primária." (FREITAS DIAS, AUGUSTO NEVES, Site: http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_pro teinas/precipitacao_proteinas.htm, acesso: 13 de novembro de 2011, as 18:28) Experiência – II Durante este procedimento, obtivemos 2 resultados destintos, nos quais foi observado uma mudança considerável de consistência e de cor. No primeiro tubo, contendo HCl, foi observado, além da mudança de consistência e cor, o surgimento de um solvente e um soluto ao fundo do tubo. Já no segundo tubo, contendo NaOH 12N, a proteína após o procedimento apresentou solidificação total além da mudança de coloração. Experiência – III Neste experimento foi possível observar que a albumina bovina ao entrar em contato com a solução de CuSO4 a 0,5% se solidifica e apresenta uma mudança de cor (esbranquiçada), enquanto no segundo tubo com uma solução de FeCl3 a 0,5% ocorreu a presença de soluto em pouca quantidade e solvente em grande quantidade; e em um terceiro tubo com acetato de chumbo foi observado apenas uma mudança na coloração da mistura, de incolor para branca. Isso por que os cations de metais pesados formam um precipitado insolúvel, com isso a carga líquida sobre a proteína é negativa, favorecendo a interação dos cátions provenientes do sal. Esse precipitado se torna mais intenso quando o pH esta acima do pI (ponto isoelétrico), ou seja, no primeiro tubo o pH estava bem acima do pI, no segundo tubo já estava mais a baixo do que no primeiro e no terceiro tubo o pH se encontrava mais baixo que o pI. Experiência – IV Com este experimento foi possível observar que ao gotejar ácido pícrico a 0,25% em uma solução de albumina bovina, a mistura apresenta uma mudança de coloração com presença de partículas de soluto e mudança de consistência. Enquanto que em um segundo tubo, ao adicionar o ácido tricloroacético a 10% o preparado muda sua coloração de incolor para levemente esbranquiçado e muda também sua consistência. Quando comparada com a experiência III, ocorre a precipitação abaixo do ponto isoelétrico. Segundo Augusto Neves (http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/precipita cao_proteinas.htm) a precipitação ocorre abaixo do pI da proteína por que a carga líquida da molécula é positiva, fazendo com que os ânions provenientes dos ácidos interajam com maior facilidade com a molécula de proteína. Experiência – V No seguinte experimento obtivemos resultados semelhante, com mudanças de cor e consistência em ambos os tubos, porém no tubo que continha acetona, observamos leve mudança de cor e consistência, enquanto que no tubo contendo butanol foi de facil percepção uma mudança mais acentuada de coloração do que de consistência. Essa reação ocorre devido ao baixo valor de constante dielétrica dos solventes orgânicos utilizados, fazendo com que a interação proteína- proteína tenha maior aproveitamento do que o poder de solvatação da água, fazendo com que a proteína precipite-se. 4.4 CONCLUSÃO Vimos que em nosso cotidiano realizamos desnaturação de proteínas sem nos darmos conta, como no simples ato de cozinhar um ovo, fazendo com que a clara do ovo se torne uma substância branca e sólida. Concluimos por meio das realizações que são varias as maneiras de promover a precipitação de proteínas, podendo ser atingindo seu ponto isoelétrico, como no caso de metais pesados. Dentre outras maneiras que influenciam na propriedade física da proteína é a temperatura que diminui a solubilidade da proteína e a ação de ácidos, bases, sais e solventes orgânicos com os quais foram realizados os experimentos. Foi possível compreender também que a desnaturação pode ser reversível ou irreversível, onde soluções desnaturadas por ação de extremos de pH, calor ou reagentes desnaturantes podem recuperar não só a sua forma nativa como também sua atividade biológica, atavés do processo de desnaturação, separando a solução de proteína e os reagentes desnaturantes, fazendo com que a solução proteica retorne as condições iniciais. 5. TITULAÇÃO DE AMINOÁCIDO 5.1 INTRODUÇÃO Um aminoácido é uma molécula orgânica formada por átomos de carbono, hidrogênio, oxigênio, e nitrogênio unidos entre si de maneira característica. Os aminoácidos são divididos em quatro partes: o grupo amina (NH2), grupo carboxílico (COOH), hidrogênio, carbono alfa (todas essas partes se ligam a ele), e um radical característico de cada aminoácido. Os aminoácidos se unem através de ligações peptídicas, formando as proteínas. Para que as células possam produzir suas proteínas, elas precisam de aminoácidos, que podem ser obtidos a partir da alimentação ou serem fabricados pelo próprio organismo. Uma solução tampão, solução tamponada ou simplesmente tampão é aquela solução capaz de manter aproximadamente constante o valor do seu pH quando é adicionado à ela um ácido ou base ou quando uma diluição ocorre, através da doação de prótons, e os aminoácidos possuem esta função tampão. "As enzimas que catalisam as reações celulares e muitas das moléculas sobre as quais elas agempossuem grupos ionizáveis com valores de pKa característicos. Os grupos aminoprotonados ( - NH3) e os grupos carboxila dos aminoácidos e os grupos fosfatos dos nucleotídeos, por exemplo, funcionam como ácidos fracos;[...] A constância do pH é conseguida primariamente através da existência de tampóes biológicos: estes são misturas de ácidosfracos e suas bases conjugadas" (LEHNINGER, NELSON, COX, 1995, pg. 71) A titulação é simplesmente a adição ou remoção gradual de prótons de uma determinada substância e nesta aula prática foi utilizado este procedimento com o objetivo de mudar o pH da solução de glicina com o intuito de observar as curvas de titulação da glicina, através da perda de prótons do grupo carboxílico (COOH), como relatam Lehninger, Nelson e Cox (1995) onde cada molécula de base que é adicionada na solução de glicina, resulta na perda de um próton deste aminoácido. 5.2 MATERIAIS E MÉTODOS Para a execução do referido procedimento foram utilizados os seguintes materiais: a) aminoácido: glicina b) solução reagente: NaOH c) materiais laboratoriais: bureta, béquer, pHmetro e pipeta. O método utilizado através desta atividade prática foi pipetar 10 ml de solução de glicina em um béquer e medir seu pH e anotá-lo e logo após, por intermédio da bureta, acrescentar 0,5 ml de solução de NaOH e aferir o pH e novamente e anotá-lo, repetindo o procedimento quantas vezes fossem necessáiro, com fins de acompanhar a mudança de pH e observar a curva de titulação da solução de glicina e poder aferir sua constante de dissociação (pK) e assim poder calcular o ponto isoelétrico (pI) da solução. Devido a glicina apresentar função de tampão, ou seja, possuir um grupo ácido capaz de doar prótons quando em contato com a base, que no nosso caso foi o NaOH, fez com que o processo se extendesse por um tempo maior. 5.3 RESULTADOS E DISCUSSÕES pK1 = 2.17 pI = 9,99 pK2 = 12,17 Como podemos observar, na literatura o pK1 da glicina é 2,3 enquanto que o pK2 é 9,6 , no entanto na nossa atividade os pKs não foram exatos com os da literatura. Isso pode ocorrer por que a glicina possui dois grupos ionizáveis com capacidade tamponante: -COOH/-COO- em pH ácido e -NH3+/-NH2 em pH alcalino e duas zonas de tamponamento entre os pHs 1,3 e 3,3 (dependente do grupo carboxila) e entre os pHs 8,6 e 10,6 (dependente do grupamento amino). 5.4 CONCLUSÃO Através da experiência realizada foi possível concluirmos que dependendo do meio em que se encontram, os aminoácidos podem receber ou doar elétrons atuando assim como ácidos (na forma protonado, podendo doar prótons), neutros (com a forma protonada e a forma receptora de prótons em equilíbrio) e base (base conjugada do ácido correspondente, ou seja, perdeu prótons e agora é receptora deles). 6.ENZIMAS – Amilase e Invertase 6.1 INTRODUÇÃO Enzimas são proteínas, estimulam reações químicas essenciais para a vida. Catalisam centenas de reações que ocorrem no metabolismo, sendo a catalise essencial para o funcionamento dos organismos em tempo apropriado. Sem catalise as reações químicas necessárias para digerir alimentos, contração de músculos ou enviar impulsos nervosos não ocorreria em velocidade util. A sua principal característica é a especialidade com o substrato, cada substrato possui uma enzima especifica, que associados se encaixam como "chave e fechadura". "A maioria das enzimas são proteínas, com exceção de um pequeno grupo de moléculas de RNA com propriedades catalíticas, todas as enzimas são proteínas. A sua atividade catalítica depende da integridade da sua conformação protéica nativa. Essa atividade catalítica geralmente se perde caso uma enzima seja desnaturada ou dissociada em subunidades. Assim as estruturas preoteicas primaria, secundaria, terciária e quaternária das enzimas são essenciais para o exercício da atividade catalítica." (LEHNINGER, NELSON, COX, 1995, pg. 99) Na aula pratica de enzimas, amilase salivar, o principal objetivo era observar através dos experimentos, as reações e resultados verificando a presença de açúcar redutor e amido. 6.2 MATERIAIS E MÉTODOS Neste experimento, Especificidade Enzimática, utilizamos os seguintes materiais:Materiais laboratoriais: Tubos de ensaio, proveta, pipetas, béquer, cálice, funil, tela de amianto, gase e bico de bunsen. Soluções: 2 ml de saliva (alunos), invertase, sacarose, amido, maltoses, glicose e frutose. a) Reagentes: reagente Benedict e reagente Lugol. Iniciando o experimento, 2ml de saliva foi diluída na porção de 1:10. Após, em quatro tubos de ensaio, identificados em tudo A, B, C e D, foram adicionados as seguintes soluções: I. 2ml de Invertase + 2ml de Sacarose 0,1M; II. 2ml de Invertase + 2ml de Amido 0,1% III. 2ml de Amilase Salivar + 2ml de Sacarose 0,1M IV. 2ml de Amilase Salivar + 2ml de Amido 0,1% Em seguida, 15 minutos de incubação a 40 OC, foi dividido o volume dos tubos B e D em duas porções: B1/B2 e D1/D2. Verificou-se a presença de Amido nas amostras B1 e D1 usando 3 gotas de Lugol, após resfriamento. Entao verificamos a presença de Acucar Redutor nas amostras B2, D2, A e C, adicionando 1ml de reagente Benedict aquecimento. 6.3RESULTADOS E DISCUSSÕES " "ENZIMA "SUBSTRATO "PRODUTORES "Reação " "A "Invertase"Sacarose "Gli/Fru "(Positivo) Telha" " " " "(Benedict) " " "B1 "Invertase"Amido "(Lugol) "(Negativo) Turvo" "B2 "Invertase"Amido "(Benedict) "(Negativo) " "C "Amilase "Sacarose "(Benedict) "(Negativo) Azul " "D1 "Amilase "Amido "Maltoses (Lugol) "(Negativo) " "D2 "Amilase "Amido "Maltoses "(Negativo) " " " " "(Benedict) "Diferente " Azul é positivo para o reagente Lugol e Telha é positivo para o reagente Benedict. Com o reagente Lugol verifica-se a presença de Amido e com reagente Benedict presença de açúcar redutor. No tubo A, observamos os seguintes resultados: a Invertase (Enzima) quebra a Sacarose (Substrato) e forma o produto, açúcar redutor, adicionando Benedict, observamos a presença de açúcares. Invertase + Sacarose = Glicose + Frutose. Resultado positivo, cor telha. No tubo B1, Invertase não hidrolisa amido, usando Lugol, foi detectado a presença de Amido. Invertase + Amido = Amido. Resultado positivo, turvo. No tubo B2, Invertase e Amido com reagente Benedict, o Amido não se transformou em açúcar redutor. Invertase + Amido = Amido. Resultado negativo, sem a presença de amido. No tubo C, Amilase e Sacarose com reagente Benedict, a amilase salivar não hidrolisa a Sacarose, desta forma não ocorreu a quebra da Sacarose em açúcar redutor. Amilase + Sacarose = Sacarose. Resultado negativo, cor azul. No tubo D1, Amilase e Amido com reagente Lugol, formação do produto Maltose, a amilase salivar quebrou o amido, e não foi identificada a presença do amido. Amilase + Amido = Maltose. Resultado negativo. No tubo D2, Amilase e amido com o reagente Benedict, formando maltose como produto, o resultado esperado seria negativo, pois o amido não se transforma em açúcar redutor. Porem em nossa solução, o resultado obtido foi diferente do esperado, positivo, não degradou todo o amido. Podem ter ocorrido diversos fatores que influenciaram no resultado. O pH, agitação, pouco amilase como já citado, pouca enzima ou desnaturação. "A atividade enzimática é afetada pelo valor do Ph. As enzimas tem um pH ótimo ou uma região de pH ótimo no qual sua atividade é máxima; em valores de pH maiores ou menores sua atividade diminui." (LEHNINGER, NELSON, COX, 1995, pg. 163) Apesar de a amilase salivar degradar amido em maltoses (fato observado no teste de Lugol) a quantidade de maltoses produzidas, não foi capaz de efetuar um resultado negativo com Benedict. A especificidade enzimática é uma característica importante, cada enzima atua e se encaixa no substrato de modo que os centros ativos coincidem perfeitamente. " Especificidade é a habilidade da enzima, de discriminar entre dois substratos competidores. Se o sitio ativo de uma enzima tem grupos funcionais arranjados de forma ótima para formar uma variedade de interações fracas com um dado substrato no estado de transição, a enzima não seria capaz de interagir tão bem com qualquer outro substrato. (LEHNINGER, NELSON, COX , 1995, pg. 153) 6.4CONCLUSÃO Com os experimentos realizados nesta aula pratica, observamos as reações e seus resultados, onde a Amilase degrada o amido em maltose, a invertase degrada a sacarose em açúcar redutor. Ao colocarmos a amilase em contato com a sacarose e a invertase em contato com o amido elas não foram degradadas, ou seja, a enzima não era especifica sobre o substrato. As reações que o resultado foi positivo, as enzimas atuaram com o substrato. Em um caso especifico no tubo D2 obtivemos um resultado diferente do esperado, que era positivo. Há diversos fatores que poderiam ter influenciado na reação como o pH, agitação, pouca amilase, pouca enzima ou desnaturação. Referências Lehninger, A.L.; Nelson, D. L.; Cox, M. M. Princípios de bioquímica. São Paulo: Sarvier, 1995. Universidade Federal de Santa Catarina. Departamento de química. O mundo das proteínas. Disponível em: www.qmc.ufsc.br/qmcweb/artigos/proteínas.html . Acesso em 14/11/ 2011 as 14:30. Universidade Estadual Paulista. Departamento de ciências farmacêuticas. Experimentos de bioquímica. Disponível em: http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/precipitac ao_proteinas.htm . Acesso em 14/11/2011 as 10:25. http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/cons t_microorg/carboidratos.htm. http://intermed99.vilabol.uol.com.br/bioquimica2.html. http://www.todabiologia.com/dicionario/lipidios.htm.