Transcript
I – Introdução As proteínas são compostos orgânicos de alto peso molecular, formadas pelo encadeamento de aminoácidos. Representam cerca do 70% do peso seco da célula sendo, portanto, o composto orgânico mais abundante de matéria viva. Proteínas correspondem a 1-1,5% da composição do leite humano e a 3-4% do leite de vaca. As principais proteínas do leite são caseína e β-lactoglobulina, que são encontradas em outros tecidos ou fluídos biológicos. Estas duas proteínas apresentam características relevantes do ponto de vista nutricional. As proteínas podem ser caracterizadas e diferenciadas por propriedades específicas como a carga elétrica, massa molar, solubilidade e afinidade por certos compostos de caráter sintético ou natural. Além disso podem também ser caracterizadas por reações de precipitação e/ou coloração. [R4]
Uma reação de coloração é a reação de Biureto. Esta reação é específica para substâncias que possuem pelo menos dois grupos CO-NH unidos por carbono ou nitrogênio como ocorre no biureto, que empresta o seu nome para a reação, essa reação só ocorre se a concentração estiver entre 1mg/L e 5mg/L. Biureto é o nome dado à estrutura originada a partir da decomposição da ureia, quando esta é submetida a uma temperatura de, aproximadamente, 180°C. E uma forma de dosar a quantidade de proteínas, principalmente a caseína é utilizando a espectrofotometria. Esta análise se baseia na capacidade de algumas soluções absorverem a luz. Considerando que a luz é definida como uma radiação eletromagnética composta de uma gama de comprimentos de ondas (nm), as análises colorimétricas se baseiam na absorção da luz visível pela substância a ser dosada e na espectrofotometria o princípio é semelhante, entretanto, o espectro de luz absorvido apresenta comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. Assim, quanto maior a concentração da molécula pesquisada, maior a absorção de luz, sendo relações diretamente proporcionais. Um raio de luz monocromática ao atravessar uma solução contendo uma substância, uma parte da luz será absorvida (Absorbância) e outra parte será transmitida atravessando a solução (Transmitância). A luz pode ser refletida pelo recipiente que contém a solução, entretanto, nas análises bioquímicas este fenômeno pode ser desconsiderado já que a natureza das cubetas (quartzo ou vidro) onde as soluções são depositadas para a leitura ou eliminadas por comparação de amostra. Pode-se escrever portanto que I0 = IA + I onde: I0 é a intensidade da luz incidente na amostra será igual a luz absorvida (I A) e a luz transmitida (I) de acordo com o esquema abaixo:
Figura 1: Representação dos fenômenos óticos
A transmitância é a razão a intensidade da luz emergente (I) e a intensidade da luz incidente (I0), isto é: T = I / I0 A absorbância (A) é definida como logaritmo negativo da transmitância e, experimentalmente, é um parâmetro mais adequado por apresentar uma relação linear com a concentração da substância absorvente. Esta relação é determinada pela Lei de Lambert-Beer que é obtida da relação de duas leis distintas: a lei de Lambert que diz que cada camada sucessiva do meio absorve uma fração igual da radiação, destacando a importância da espessura da cubeta usada; a lei de Beer determina a relação entre a absorção e a concentração da substância em solução, sendo razões diretamente proporcionais. [R4]
II – Objetivo Determinar a concentração de caseína no leite pelo método espectrofotométrico.
III - Materiais e Métodos 1) Materiais • Tubos de ensaio de vidro com e sem tampa • Bastão de vidro • Pipetador manual • Pipetas de 1, 2, 5 e 10 mL • Becker de 100 mL • Estante para tubos de ensaio • Espectrofotômetro • pHmetro
2) Reagentes • Leite desnatado • Solução de ácido clorídrico a 2% • Solução mãe de caseína a 5mg/mL • Reagente de Biureto
3) Métodos Inicialmente foram preparados os tubos 7 e 8. Na preparação do tubo 7 houve a precipitação da caseína, pelo método de precipitação isoelétrica. Foi diluído 10 mL de leite em 10 mL de água destilada em um
becker de 100 mL. Posteriormente, transferiu-se ao becker aproximadamente 2 mL de solução de ácido clorídrico 2 %, com a intenção de ajustar o pH a uma faixa entre 4 e 5, onde ocorre a precipitação da caseína (pI da caseína = 4,6). Com o auxílio do professor, o pH foi analisado no pHmetro. Por fim, solução do becker foi filtrada e foi transferido 1 mL do sobrenadante para um tubo de centrífuga (tubo 7). O procedimento do tubo 8 foi o seguinte: em um tubo de ensaio se adicionou 0,5 mL de leite e 9,5 mL de água destilada. Desta solução pipetou-se 1 mL para um outro tubo de ensaio (tubo 8). Os tubos de 1 ao 6 foram preparados depois para a preparação da curva de calibração. Foi se adicionando em cada um dos tubos volumes da solução mãe (5 mg/mL de caseína) e de água destilada nas proporções descritas no Quadro 1. Em todos os tubos (1 ao 8) foi adicionado 5 mL reagente de biureto.
Quadro 1: Dosagens para preparação da curva de calibração Tubos Solução mãe (5 mg/mL de caseína) Água destilada (mL) Reagente de biureto (mL) Amostra (mL)
1 0 1,0 5 0
2 0,2 0,8 5 0
3 0,4 0,6 5 0
4 0,6 0,4 5 0
5 0,8 0,2 5 0
6 1,0 0 5 0
7 0 0 5 1,0
8 0 0 5 1,0
IV – Resultados e Discussão Após análise dos tubos no espectrofotômetro, obtiveram-se os valores de absorbância para cada um, que se encontram no Quadro 2: Quadro 2: Valores de absorbância Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8
Absorbância (540 nm) branco 0,038 0,076 0,116 0,163 0,196 0,100 0,136
O tubo 1 da curva de calibração é adotado como branco, pois o valor do mesmo é a absorbância apenas do reagente de biureto, então seu valor é descontado dos outros tubos pelo espectrofotômetro. A solução presente no tubo 7 é o sobrenadante da precipitação da caseína através do seu ponto isoelétrico, que é atingido em um pH entre 4 e 5. O equilíbrio entre as cargas positivas e negativas no ponto isoelétrico torna a carga da molécula da caseína nula, o que reduz a repulsão entre as moléculas da proteína e a força de interação com o solvente tornando-a apolar, provocando a sua separação do resto das proteínas. O sobrenadante continha no entanto, as restantes proteínas presentes no leite, que ao ser lida no espetrômetro apresentou uma absorbância de 0,100 AU, demonstrado na Tabela 2.[R5]
No tubo 8 foi feita uma diluição para uma concentração 10x menor do que a concentração original do leite. Possuindo então todas as proteínas do leite ainda em solução. As soluções padrão aqui analisadas, obedecem a lei de Lambert-Beer, tendo em vista que a medida em que se as concentrações aumentaram, a absorbância destas aumentaram proporcionalmente, podendo assim encontrar as concentrações da amostra a partir de uma curva de calibração. O comprimento de onda de 540nm utilzado nesse método, trata-se do máximo de absorção da caseína, sendo esécífico de cada substância. O reagente de biureto forma um complexo estável com as proteínas de coloração violácea, o que caracteriza as diferentes colorações nos tubos. Logo, a intensidade da cor depende exclusivamente da concentração de proteína; quanto maior a concentração de proteínas mais intensa é a coloração do tubo. Isso pode ser verificado na imagem abaixo (Figura 2):[R1]
Figura 2: Relação dos tubos e suas colorações
Denomina-se Biureto a estrutura originada a partir decomposição da uréia, quando a mesma é submetida a uma temperatura de, aproximadamente, 180°C:
Figura 3: Decomposição da uréia[R3]
O reagente de Biureto é um reagente analítico feito de hidróxido de potássio (KOH), sulfato de cobre II (CuSO4) e o sal duplo tartarato de sódio e potássio (KNaC4H4O6·4H2O).[R5] O NaOH tem a função de promover alcalinidade ao meio; o tartarato de sódio e potássio é um agente complexante, responsável por complexar os íons Cu2+,para que este não reaja com OH - e forme Cu(OH)2; o sulfato cobre é necessário para promover a formação de um complexo entre o íon Cu2+ e a cadeia polipeptídica da proteína.
Compostos que possuem duas ou mais ligações peptídicas são capazes de reagir com sais de cobre em meio alcalino. Essa reação resulta num produto de coloração violeta que deve-se a formação de um complexo entre o íon Cu2+ e os grupos -NH da cadeia peptídica. [R4]
Figura 4: Complexação do Cu2+ e a proteína [R3]
Esse método é denominado de "método de biureto", pois o biureto quando em meio alcalino e em presença de Cu2+, forma um complexo de coloração semelhante à apresentada entre os íons Cu2+ e as cadeias polipeptídicas. [R4]
Figura 4: Interação do íon Cu2+ e o biureto [R3]
Curva de calibração Quadro 3: Curva de calibração Tubos Absorbância
1 0
2 0,038
3 0,076
4 0,116
5 0,163
6 0,196
[ ] mg/ml
0
1
2
3
4
5
Quadro 4: Concentração de Caseína nos Tubos - Cálculos Tubo I
Tubo II
Tubo III
Tubo IV
Tubo V
Tubo VI
Branco C = 0 mg/ mL
C1V1 = C2V2 5.0,2 = C2.1 C2 = 1 mg/mL
5.0,4 = C2.1 C2 = 2 mg/mL
5.0,6 = C2.1 C2 = 3 mg/mL
5.0,8 = C2.1 C2 = 4 mg/mL
5.1 = C2.1 C2 = 5 mg/mL
Concentração das proteínas no sobrenadante (Tubo VII) 0,100= 0,0399x-0,0015 0,0399x = 0,100+0,0015 X = 2,544mg/mL - Concentração das proteínas do sobrenadante no leite 2,544x20 = Cx10 C = 5,088mg/mL C = 0,5088 % m/v
Concentração das proteínas totais (Tubo VIII) 0,136 = 0,0399x – 0,0015 0,0399x = 0,136 + 0,0015 X = 3,446 mg/mL - Concentração das Proteínas totais no leite 3,446x10 = Cx0,5
C= 68,92mg/mL C= 6,892 % m/v
Concentração de Caseína no leite Caseína = PT - PS Caseína= 68,92 – 5,088 Caseína = 63,83mg/mL
Teor de caseína em relação as outras proteínas Pt ---------- 100% Caseína---- x 68,92-------100% 63,83--------x X= 92,61 %
Os resultados obtidos experimentalmente não coincidiram com a informação nutricional presente na embalagem do leite, que apresentava concentração de proteínas totais de aproximadamente 6g/200mL. O valor encontrado foi de 6,892g/100mL, ao converter para a unidade presente no rótulo é encontrado uma concentração de 13,784g/200mL, superando o valor do rótulo em 127,73%. Também foi encontrado um valor consideravelmente alto de porcentagem de caseína em relação aos proteínas totais. O valor encontrado foi de 92,61% e o esperado próximo a 80%, apresentando uma diferença de 15,76%. Subentende-se que a causa de resultados tão discrepantes tenha sido oriundo da preparação e leitura da amostra do tubo 7 e 8. Sabendo que no momento da leitura do espectro notou-se uma nuvem presente no tubo, indicando que não houve a total separação da caseína do sistema, provocando o erro. Para amenizar o erro um outro grupo nos cedeu seu resultado. V - Conclusão De acordo com os dados nutricionais do leite, a concentração de caseína é de 80%, no entanto, no experimento encontramos um valor superior que foi de 92,61%. Isto ocorreu, provavelmente, devido a um possível erro experimental.
VI - Referências Bibliográficas [R1] www.ufrgs.br/gcoeb/dosagemproteina/, acessado em 22/05/2016, às 14h17 [R2]http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradasdois3.htm [R3] Ribon, Andréa de Oliveira Barros et al Queiroz, José Humberto de. Práticas de Bioquímica . Páginas 91 e 92. MG; Editora UFV, 2007 [R4]CISTERNAS, José Raul; VARGA, José; MONTE, Osma / Fundamentos da Bioquímica Experimental / 2°edição – São Paulo. Editora Atheneu, 2001. [R5] http://www.abq.org.br/cbq/2012/trabalhos/14/557-14229.html, acessado em 23/05/2016 ás 23h45.
