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Sumário
OBJETIVOS 2
INTRODUÇÃO 2
2.2 Estruturas 3
2.2.1 Estrutura primária 3
2.2.2 Estrutura secundária 3
2.2.3 Estrutura terciária 3
2.2.4 Estrutura quaternária 4
2.3 Reação da Ninhidrina 4
2.4 Reação do Biureto 5
2.5 Precipitação de proteínas com desnaturação 5
2.6 Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides 5
2.7 Precipitação por reação com metais pesados 5
2.8 Precipitação por reação com solventes orgânicos 6
2.9 Efeito da força iônica sobre a solubidade (Salting In) 6
2.10 Reações de precipitação sem desnaturação (Salting Out) 6
3. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL 6
3.1 Materiais a serem utilizados nos procedimentos a seguir 6
3.2 Reações de coloração de proteínas 7
3.2.1 Reação com ninhidrina 7
3.2.2 Reação do biureto 7
3.3 Reações de precipitação de proteínas 8
3.3.1 Reações de precipitação com desnaturação 8
3.3.2 Reações de precipitação sem desnaturação 9
4. RESULTADOS E DISCUSSÕES 10
5. CONCLUSÕES 12
OBJETIVOS
A presente atividade experimental tem a finalidade de identificar e
caracterizar a presença de proteínas em material biológico. Verificar,
experimentalmente, a precipitação de proteínas com e sem desnaturação e
relacionar as observações práticas com a teoria de propriedades gerais como
estrutura e isolamento de proteínas.
INTRODUÇÃO
2.1 O que são proteínas
As proteínas são as moléculas orgânicas mais abundantes e importantes
nas células e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. São encontradas em
todas as partes de todas as células, uma vez que são fundamentais sob todos
os aspectos da estrutura e função celulares. Existem muitas espécies
diferentes de proteínas, cada uma especializada para uma função biológica
diversa. Além disso, a maior parte da informação genética é expressa pelas
proteínas.
Pertencem à classe dos peptídeos, pois são formadas por aminoácidos
ligados entre si por ligações peptídicas. Uma ligação peptídica é a união
do grupo amino (-NH 2 ) de um aminoácido com o grupo carboxila (-COOH) de
outro aminoácido, através da formação de uma amida.
São os constituintes básicos da vida: tanto que seu nome
deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro lugar". Nos
animais, as proteínas correspondem a cerca de 80% do peso dos músculos
desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do sangue seco. Mesmo nos vegetais
as proteínas estão presentes.
A importância das proteínas, entretanto, está relacionada com suas
funções no organismo, e não com sua quantidade. Todas as enzimas
conhecidas, por exemplo, são proteínas; muitas vezes, as enzimas existem em
porções muito pequenas. Mesmo assim, estas substâncias catalisam todas as
reações metabólicas e capacitam aos organismos a construção de outras
moléculas - proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios - que são
necessárias para a vida.
Todas contêm carbono, hidrogênio, nitrogênio e oxigênio, e quase todas
contêm enxofre. Algumas proteínas contêm elementos adicionais,
particularmente fósforo, ferro, zinco e cobre. Seu peso molecular é
extremamente elevado.
Todas as proteínas, independentemente de sua função ou espécie de
origem, são construídas a partir de um conjunto básico de vinte
aminoácidos, arranjados em várias seqüências específicas.
2.2 Estruturas
As proteínas podem ter 4 tipos de estrutura dependendo do tipo de
aminoácidos que possui, do tamanho da cadeia e da configuração espacial da
cadeia polipeptídica. As estruturas são:
2.2.1 Estrutura primária
É dada pela seqüência de aminoácidos ao longo da cadeia polipeptídica.
É o nível estrutural mais simples e mais importante, pois dele deriva todo
o arranjo espacial da molécula. São específicas para cada proteína, sendo,
geralmente, determinadas geneticamente. A estrutura primária da proteína
resulta em uma longa cadeia de aminoácidos, com uma extremidade "amino
terminal" e uma extremidade "carboxi terminal". Sua estrutura é somente a
seqüência dos aminoácidos, sem se preocupar com a orientação espacial da
molécula. Suas ligações são ligações peptídicas e pontes dissulfeto.
Representada pela sequência de aminoácidos unidos por meio das
ligações peptídicas. É ligada a carboidratos assim como outro.
2.2.2 Estrutura secundária
É dada pelo arranjo espacial de aminoácidos próximos entre si na
sequência primária da proteína. É o último nível de organização das
proteínas fibrosas, mais simples estruturalmente.
Ocorre graças à possibilidade de rotação das ligações entre os
carbonos alfa dos aminoácidos e os seus grupos amina e carboxilo. O arranjo
secundário de uma cadeia polipeptídica pode ocorrer de forma regular; isso
acontece quando os ângulos das ligações entre carbonos alfa e seus ligantes
são iguais e se repetem ao longo de um segmento da molécula.
São dois os tipos principais de arranjo secundário regular:
alfa-hélice: presente na estrutura secundária dos níveis de
organização das proteínas. São estruturas cilindricas
estabilizadas por pontes de hidrogénio entre aminoácidos. As
cadeias laterais dos aminoácidos encontram-se viradas para fora.
Existem várias formas de como as hélice alfa podem organizar-se.
folha-beta: padrão estrutural encontrado em várias proteínas,
nas quais regiões vizinhas da cadeia polipeptídica associam-se
por meio de ligações de hidrogénio, resultando em uma estrutura
achatada e rígida
2.2.3 Estrutura terciária
Resulta do enrolamento da hélice ou da folha pregueada, sendo
estabilizada por pontes de hidrogênio e pontes dissulfeto. Esta estrutura
confere a atividade biológica às proteínas.
A estrutura terciária descreve o dobramento final de uma cadeia, por
interações de regiões com estrutura regular ou de regiões sem estrutura
definida, podendo haver interações de segmentos distantes de estrutura
primária, por ligações não covalentes.
Enquanto a estrutura secundária é determinada pelo relacionamento
estrutural de curta distância, a terciária é caracterizada pelas interações
de longa distância entre aminoácidos, denominadas interações hidrofóbicas,
pelas interações eletrostáticas, pontes de hidrogenio e de sulfeto. Todas
têm seqüências de aminoácidos diferentes, refletindo estruturas e funções
diferentes. Efetua interações locais entre os aminoácidos que ficam
próximos uns dos outros.
2.2.4 Estrutura quaternária
Algumas proteínas podem ter duas ou mais cadeias polipeptídicas. Essa
transformação das proteínas em estruturas tridimensionais é a estrutura
quaternária, que são guiadas e estabilizadas pelas mesmas interações da
terciária.A junção de cadeias polipeptídicas pode produzir diferentes
funções para os compostos.
Um dos principais exemplos de estrutura quaternária é a hemoglobina.
Sua estrutura é formada por quatro cadeias polipeptídicas.
Figura 1 - Estrutura da Hemoglobina
2.3 Reação da Ninhidrina
A reação da Ninhidrina é de extrema importância na Bioquímica e é
utilizada na detecção de aminoácidos por ter a característica amina
primária. Por ser um agente oxidante muito poderoso, a ninhidrina reage com
o aminoácido da cadeia, dando origem a um composto de cor púrpura.
2.4 Reação do Biureto
O reagente de biureto é um reagente analítico feito de hidróxido de
potássio (KOH) e sulfato de cobre (II) (CuSO4), junto com tartarato de
sódio e potássio (KNaC4H4O6·4H2O). Este reagente de coloração azul torna-se
violeta na presença de proteínas, e muda para rosa quando combinado com
polipeptídeos de cadeia curta. O esquema abaixo representa um modelo da
formação desse complexo:
" " " "
" "Figura 2 - Estrutura do" "
" "complexo " "
2.5 Precipitação de proteínas com desnaturação
A temperatura é um fator importante na solubilização das proteínas. Em
geral, entre O e 40(C o aumento da temperatura favorece a solubilidade.
Isto decorre do fato do calor provocar um aumento da energia cinética das
moléculas de proteína, facilitando a interação destas com o solvente.
Entretanto, acima de 40(C, as proteínas começam a precipitar: os movimentos
moleculares se tornam tão intensos que os grupamentos químicos se afastam
além da distância permitida para se reassociarem, aproximando-se de outros
com os quais se associam. Assim, ocorre o rompimento das estruturas
secundária, terciária e quaternária e a proteína adquire outra conformação,
uma conformação inativa (desnaturada).
2.6 Precipitação por reação com os reagentes para alcalóides
Os ânions de alcalóides (TCA) são capazes de se combinar com proteínas
que possuam resíduos de aminoácidos na forma de cátions, formando complexos
insolúveis que se precipitam e caracterizam a desnaturação.
2.7 Precipitação por reação com metais pesados
Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+
formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o
elemento formador (exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo,
etc.). Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto
isoelétrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre a
proteína é negativa (ver determinação do ponto isoelétrico da caseína),
favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal.
2.8 Precipitação por reação com solventes orgânicos
A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em
água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de
soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de
interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A
água apresenta constante dielétrica bastante elevada
A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura.
Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são
bastante úteis na separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais
elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por rompimento das
pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares, importantes
na manutenção da conformação protéica.
2.9 Efeito da força iônica sobre a solubidade (Salting In)
Em baixas concentrações de sais (baixa força iônica), a solubilidade
em geral aumenta, pois os íons salinos tendem a se associar às proteínas
contribuindo para uma hidratação e/ou repulsão entre as moléculas,
aumentando a solubilidade "salting in".
2.10 Reações de precipitação sem desnaturação (Salting Out)
A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das
proteínas é uma função de sua força iônica, que tanto depende de sua
concentração como da valência de cátions e ânions que formam o sal. Em
altas forças iônicas, conseguidas pela adição de grandes quantidades de um
sal muito solúvel (por exemplo, o sulfato de amônio) a uma solução de
proteína, pode ocorrer remoção de moléculas de água de hidratação das
proteínas, o que leva à predominância das interações proteína-proteína,
resultando em precipitação, fenômeno conhecido como salting-out
" "
PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
3.1 Materiais a serem utilizados nos procedimentos a seguir
10 Tubos de ensaio
01 Béquer de 50 mL
04 pipetas graduadas de 5 mL
04 pipetas graduadas de 2 mL
01 pipeta graduada de 10 mL
01 bastão de vidro
Estante para tubos de ensaio
Prendedor de tubos de ensaio (para aquecimento)
Pipetas de Pasteur
Peras
Bico de Bunsen
Caneta hidrográfica
Pisseta com água destilada
3.2 Reações de coloração de proteínas
3.2.1 Reação com ninhidrina
Reagentes:
Solução de ninhidrina a 0,1% em tampão fosfato pH 7,0 (10mM)
Solução de proteínas: clara de ovo a 10% v/v e, solução salina
0,9%
Solução de glicina 0,1%
Procedimento:
Numerou-se 02 tubos de ensaio em que no primeiro adicionou-se 2
mL da solução de ninhidrina e 5 gotas de proteínas e aqueceu em
chama direta durante aproximadamente 2 minutos. Observou-se o
aparecimento de coloração;
No segundo tubo de ensaio colocou-se 2 mL da solução de
ninhidrina com 5 gotas de glicina e ferveu em chama direta
durante aproximadamente 2 minutos. Observou aparecimento de
coloração.
3.2.2 Reação do biureto
Reagentes:
Solução de hidróxido de sódio 2,5 M
Solução de sulfato de cobre 1%
Solução de proteína: clara de ovo a 10% v/v em solução salina
0,9%
Solução de glicina 0,1%
Procedimento:
Numerou-se 03 tubos de ensaio e colocou-se no primeiro tubo, 1
mL da solução de proteínas com 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas
de sulfato de cobre 1%. Observou-se se houve aparecimento de
coloração;
No segundo tubo adicionou-se 1 mL de solução de glicina com 5
gotas de e NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de cobre 1%. Observou-
se o aparecimento de cor e comparou-se esta com a do tubo 03;
No terceiro tubo colocou-se 1 mL de água estilada juntamente com
5 gotas de com 5 gotas de NaOH 2,5 M e 3 gotas de sulfato de
cobre 1%. Observou-se o aparecimento de coloração e comparou-se
esta com o tubo 02. Este tubo corresponde ao branco.
3.3 Reações de precipitação de proteínas
3.3.1 Reações de precipitação com desnaturação
Reagentes:
Solução de proteínas preparada pela diluição de clara de ovo a
10% v/v com solução salina (NaCl 0,9g% (p/v))
Ácido tricloroacético (TCA) a 10% (p/v)
Álcool etílico absoluto
- Precipitação por ação do calor
Procedimento:
Em um tubo de ensaio colocou-se 2 mL da solução de proteínas e
este tubo foi aquecido diretamente na chama e observou-se.
- Precipitação por reação com reagentes para alcalóides
Procedimento:
Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da solução de proteínas e 1
mL de ácido tricloroacético (TCA) e observou-se.
- Precipitação com metais pesados
Procedimento:
Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da solução de proteínas e 1
mL de acetato de chumbo a 5% e observou-se o ocorrido.
- Precipitação por ação de solventes orgânicos
Procedimento:
Em um tubo de ensaio colocou-se 1 mL da solução de proteínas e
de 1 a 3 volumes (até o aparecimento de precipitado) de álcool
etílico e observou-se.
3.3.2 Reações de precipitação sem desnaturação
(efeito força iônica sobre a solubilidade das proteínas)
Reagentes:
Clara de ovo "in natura"
Cloreto de sódio 1 M
Solução saturada de sulfato de amônio 76,6 g% (p/v)
- Solubilização ("salting in")
Procedimento:
Colocou-se em um béquer 3 mL de clara de ovo e diluiu-se este
com um pequeno volume de água destilada, sob agitação suave com
o bastão de vidro até o aparecimento de precipitado. Após foi
adicionado gota a gota a solução de NaCl até a redissolução
deste precipitado.
- Precipitação ("salting out")
Procedimento:
Pipetou-se 2 mL da solução do procedimento anterior ("salting
in") em um tubo de ensaio.Foi adicionado 2 mL de solução
saturada de sulfato de amônio e observou a formação de um
precipitado. Após colocou-se de 6 mL de água destilada até a
redissolução deste precipitado.
RESULTADOS E DISCUSSÕES
1. – Reações de coloração de proteínas
1. – Reação com ninhidrina
Tabela 01 – Dados experimentais reação com ninhidrina.
"Tubos "Evidências "
"01 "Logo no inicio do aquecimento observou-se a mudança de "
" "coloração da solução que antes era incolor e tornou-se violeta "
" "opaco (tom claro) "
"02 "Observou-se a mudança de coloração da solução que antes era "
" "incolor e tornou-se violeta opaco (tom escuro, quase azul) "
2. – Reação do biureto
Tabela 02 – Dados experimentais reação com biureto
"Tubos "Evidências "
"01 "Observou-se a mudança de coloração: de incolor para violeta "
" "transparente. Portanto, a resposta é positiva para a reação – "
" "precipitação de proteínas "
"02 "Observou-se a mudança de coloração: de incolor para azul opaco "
" "(tom claro) "
"03 "BRANCO. Observou-se novamente a mudança de coloração: de "
" "incolor para azul opaco (tom claro) "
Comparação das reações do tubo 2 com o 3:
O tubo 03 é o branco, ou seja, o teste com os reativos necessários
para precipitação de proteínas, mas sem as proteínas presentes, apenas para
comparar caso os testes sejam positivos (precipitação de proteínas – cor
violeta) ou negativos (não precipitação de proteínas – cor azul).
O tubo 02 apresentou a mesma coloração do branco, entretanto o sistema
do tubo 02 continha 1 mL de glicina que é o aminoácido mais simples que
existe e portanto ele tem grupamentos amina disponíveis para reação.
Figura 3 - Estrutura da Glicina
2. – Reações de precipitação de proteínas
1. – Reações de precipitação com desnaturação
Tabela 03 – Dados experimentais das reações de precipitação com
desnaturação
"Reações – precipitação"Evidencias "
"Ação do calor "Com pouco aquecimento já se observou a formação"
" "do coagulo de coloração branca leitosa "
"Reagentes para "No momento da adição já se observou a formação "
"alcalóides "do precipitado de coloração branca "
"Sais de metais pesados"Observou-se a formação do precipitado na forma "
" "de pequenos fios, mas a solução continuou com "
" "cor inicial "
"Solventes orgânicos "Com a adição de 1 mL já foi possível observar a"
" "formação do precipitado de cor branca (aspecto "
" "leitoso) "
2. – Reações de precipitação sem desnaturação
(efeito força iônica sobre a solubilidade das proteínas)
Tabela 04 – Dados experimentais das reações de precipitação sem
desnaturação
"Reações "Evidencias "
" "Com aproximada mente 10 gotas de água, já foi "
"Solubilização"possível observar pequenos fios brancos na clara do "
"("salting "ovo – precipitado. Com a adição de um volume muito "
"in") "maior que o de água, de NaCl foi possível a "
" "redissolução do precipitado anteriormente formado. "
" "A solução com a adição do sulfato de amônio ficou "
"Precipitação "turvada. Pode-se identificar o precipitado de cor "
"("salting "branca formado. Com a adição de água a solução que "
"out") "era turva voltou a ser transparente, mas ainda "
" "continha alguns precipitados dispersos na solução "
CONCLUSÕES
As reações de coloração e precipitação de proteínas permitem a
caracterização dessas pela análise de suas propriedades químicas e físicas,
como ligações peptídicas, solubilidade e estrutura molecular. Várias
reações específicas são empregadas para detectar cada tipo de proteína, de
forma qualitativa e, posteriormente, quantitativa.
As reações de coloração não alteram a estrutura da proteína, ao
contrário das reações de precipitação que podem alterar vários tipos de
estruturas protéicas. Já as denominadas de "Salting in" e "Salting out"
precipitam material sem ocorrer desnaturação.
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Kehl, Anderson & Langbeck, Carmem. Caracterização de Proteínas. Centro
Federal de
Educação Tecnológica do Amazonas. Manaus, 2008.
Lehninger, A. Lester. Fundamentos de Bioquímica. 4ª ed. São Paulo:
Sarvier, 2006
Sites:
http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/disc_eng_bioq/trabalhos_pos2003/cons
t_microorg/proteinas.htm
http://pt.wikipedia.org/wiki/Prote%C3%ADna
http://misodor.com/HEMOGLOBINA.php
http://pt.wikipedia.org/wiki/Reagente_de_biureto
http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/preci
pitacao_proteinas.htm
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Bioquímica I – Primeira aula pratica: Proteínas
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Bioquímica I – Primeira Aula Prática: Proteínas
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