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Curso Técnico em Biotecnologia Cultura de Tecidos Vegetais
Estabelecimento de culturas in vitro de Ocimum basilicum L.
Pelo menos quatro espécies do gênero Ocimum (família Lamiaceae) - O. americanum, O. basilicum, O.gratissimum e O. sanctu, têm grande importância econômica devido a suas propriedades farmacêuticas e aromáticas (como temperos ou fonte de óleos essenciais). O manjericão (ou alfavaca) - O. basilicum, é talvez a espécie mais explorada. Com grande número de cultivares e propagação tipicamente por sementes, esta cultura exibe enorme variação fenotípica (inclusive na produção de substâncias de interesse). Assim, atualmente já se busca alternativas para o melhoramento genético da espécie, de modo a otimizar a produção e contornar problemas como susceptibilidade a doenças. (Fonte: Mandal et alli, 2000. ICDB-Plant, 36:287-292; Deschamps ·e Simon, 2002. Pl.CellRep, 21:359–364)
A maior dificuldade da desinfestação é obter tecido descontaminado sem consuzi-lo à morte. Os pré-tratamentos aplicados na planta matriz podem ser determinantes para o sucesso desse processo. Várias substâncias germicidas são usadas para a desinfestação de explantes. As mais comuns são etanol e compostos a base de cloro, como hipoclorito de sódio ou cálcio. Outros agentes utilizados incluem o cloreto de mercúrio, ácido clorídrico, cloreto de benzalcônio e peróxido de hidrogênio. É comum adicionar detergente (ex.: Tween 20) às soluções germicidas para melhorar o contato com os tecidos. O etanol também é utilizado como surfactante e é comumente utilizado antes de outros germicidas. Exemplo de etiqueta:
I. Material Ob MS0 01/01/09 G3
1. Material Vegetal estacas de manjericão (Ocimum basilicum L.) 2. Soluções germicidas etanol 70% hipoclorito de sódio a 1% (ou água sanitária comercial , contendo ~5% de cloro livre, a 20%) 3. Material para manipulação asséptica (ver Protocolo “Preparo da câmara de fluxo laminar (CFL) para manipulação asséptica”) 4. Béquer de 250 mL 5. Béquer de 1 L (para descarte) 6. Vidros contendo 20 mL de meio MS0
** Lembre-se: uma tabela bem apresentada deve ser facilmente entendida. Isto é conseguido pela utilização de cabeçalhos autoexplicativos e, principalmente, pela organização dos dados nas linhas e colunas ("quem fica onde"). Nunca: liste os dados simplesmente, sem qualquer tipo de agrupamento mais apurado; deixe de colocar médias ou totais, o que for mais conveniente; deixe de anotar as legendas para símbolos ou abreviações.
II. Procedimento: Para explantes oriundos de campo realizam-se todas as etapas. Para explantes oriundos de casa de vegetação ou tratados com fungicidas ou outra substância germicida, o protocolo inicia-se na etapa 4. 1. Lavar o material em água contendo 10 gotas de detergente 2. Enxaguar bem em água corrente 3. Enxaguar 1 vez em água deionizada ou destilada 4. Em condições assépticas (CFL), prosseguir as lavagens como se segue: Etanol 70% - 1 min. Hipoclorito de sódio (água sanitária) - 15 min. Água destilada estéril - 3 a 4 lavagens (~1 min) 5. Com auxílio de pinça e bisturi, retirar a base das estacas, esbranquiçada pelo tratamento anterior 6. Introduzir a base das estacas cerca de 5 mm dentro do meio de cultura, 5 estaca/vidro 7. Fechar os tubos com filme transparente de PVC 8. Etiquetar os vidros com o nome do vegetal (usar como código as iniciais do nome científico), meio de cultura, data e número do grupo (usar "G1", "G2", etc). 9. Incubar o material sob fotoperíodo de 16/8 h de luz e temperatura de 20 a 28OC III. Resultados Acompanhe o desenvolvimento de suas culturas, avaliando a taxa de contaminação e o desenvolvimento do material. Esse desenvolvimento será medido pelo número (e porcentagem) de brotos e/ou raízes formados, tamanho (altura) de brotos formados, existência de anomalias, etc. Expresse seus resultados de maneira clara e objetiva (número total de frascos introduzido, percentagem de contaminação, etc.) e compare com os resultados obtidos pelos outros grupos.
