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C u r s o T é c n i c o e m B io t e c n o l o g i a C u l t u r a de T e c i do s V e g e t a i s
Preparo de Meio de Cultura Os meios de cultura para células e tecidos vegetais são constituídos por misturas de sais minerais, que fornecem todos os macro e micronutrientes, sacarose, vitaminas e mio-inositol; estas são chamadas de meio básico ou meio basal (Tabelas 1 e 2). A água, constituinte utilizado em maior quantidade nos meios de cultura, deve ser pura e, especialmente, livre de íons. Pode ser desionizada, destilada, bidestilada ou purificada por sistemas especiais como o “Milli-Q”. A sacarose é a fonte de carbono para os vegetais em cultura, substituindo o CO2 fixado na fotossíntese. Esta não ocorre in vitro nos mesmos níveis observados in vivo por causa de limitações impostas pelas próprias condições de cultura. A sacarose é adicionada ao meio de cultura em concentrações de 2 a 3 %. As vitaminas mais utilizadas nos meios de cultura e suas funções conhecidas no metabolismo vegetal são descritas na Tabela 3. O mio-inositol é um hexitol, um composto de 6 carbonos com hidroxilas ligadas a todos eles, cuja função fisiológica está ligada ao metabolismo de auxinas (são encontrados no floema conjugados de inositol-ácido indolacético), à estabilização de membranas, principalmente do cloroplasto, e à síntese de ácido ascórbico e pectina (componente da parede celular). Uma substância presente em todos os meios de cultura é o EDTA, utilizado como quelante de íons de ferro. Outros quelantes, como EGTA, EDDH, DTPH, DHTTA, e CDTA podem substituí-lo. Também podem ser adicionados ao meio de cultura, suplementos especiais cuja composição não é totalmente conhecida, as chamadas misturas complexas. Os exemplos mais comuns são água de coco e extratos de polpa de banana, mas já foi descrito o uso de extratos de malte, tomate e outros, assim como de hidrolizados de proteínas, principalmente caseína. Para culturas com objetivos específicos podem ser adicionados ao meio antibióticos, fungicidas, filtrados de culturas de fungos, etc. O uso desses suplementos é justificado pelo efeito positivo observado no crescimento das culturas, mas deve ser evitado uma vez que sua composição variável compromete a repetibilidade dos protocolos. Outro componente eventual dos meios de cultura é o carvão ativado, usado na concentração de 0,3 a 1%. Devido à sua capacidade de adsorver substâncias, o carvão ativado pode causar feitos benéficos no crescimento das culturas (por exemplo, ao adsorver substâncias tóxicas secretadas pela cultura ou presentes no ágar, como contaminantes). Em função do tipo de cultura, estes meios podem ser solidificados ou não, sendo o ágar o agente gelificante mais utilizado, em concentrações de 0,4 a 1%. Outro agente gelificante comum é o “Gelrite” ou “Phytagel”. A indução de diferentes padrões de crescimento nas culturas é dada pela presença de hormônios ou reguladores de crescimento nos meios de cultura (Tabela 4). Os meios de cultura para vegetais têm pH ajustado para 5,4 a 5,8. Esta é a faixa mais comum, embora possa variar para algumas culturas. Nesta faixa de pH, os sais estão dissociados nas formas iônicas preferencialmente absorvidas pelas plantas. O pH normalmente é ajustado com KOH (ou NaOH) e HCl, antes da autoclavagem, mas o meio também pode ser tamponado, pela adição de MES (ácido 2-[N-morfolino] etano sulfônico). Para o preparo dos meios de cultura os laboratórios de cultura de tecidos vegetais utilizam geralmente soluções estoques de substâncias inorgânicas, que são fontes de macro e micronutrientes. A composição de cada solução pode variar de acordo com o agrupamento de diferentes elementos. Por exemplo, os micronutrientes podem estar todos colocados numa única solução ou, por outro lado, separados em soluções que agrupam diferentes sais (sulfatos, fosfatos, etc.). Exemplos de soluções estoque são dados nas Tabelas 5 e 6. Os outros componentes do meio de cultura também podem ser armazenados em soluções estoque. Sugestões de concentrações dessas soluções estão nas Tabelas 7 e 8. Todas as soluções estoque podem ser guardadas em geladeira ou freezer. A esterilização dos meios de cultura é feita por autoclavagem a 121oC, 1 atm, por 15 a 20 minutos. Alguns hormônios e vitaminas, bem como os antibióticos em geral, são degradados pela alta temperatura, por isso são filtrados em membranas de 0,45 ou 0,22 µm e adicionados ao meio já autoclavado.
2 Tabela 1. Composição dos meios de White (1943)1, Murashige e Skoog (1962) e Gamborg et al (1968) –B5. (Fonte: Torres e Caldas, 1990) * A formulação usa a preparação comercial Sequestrene.
1
Com acréscimo de cobre e molibdênio.
Concentrações Componentes
White mg/L
Macronutrientes Ca(NO3)2 4H2O . NH4NO3
MS mM
mg/L
B5 mM
mg/L
mM
300
1,27
-
-
-
-
-
-
1.650
20,60
-
-
-
-
-
-
134
1,01
80
0,79
1.900
18,80
2.500
24,70
-
-
440
2,99
150
1,02
720
2,92
370
1,50
250
1,01
KH2PO4
-
-
170
1,25
-
-
KCl Na2SO4
65 200
0,87 1,41
-
-
-
-
NaH2PO4.H2O
16,5
0,12
-
-
150
1,05
Micronutrientes MnSO4.4H2O
5,3
0,031
22,3
0,1000
-
-
-
-
-
-
10,0
0,059
ZnSO4.7H2O
3,0
0,010
8,6
0,0299
2,0
0,007
H3BO3
1,5
0,024
6,2
0,1000
3,0
0,048
KI Na2MoO4.2H20
0,75 -
0,0045 -
0,83 0,25
0,005 0,001
0,75 0,25
0,0045 0,001
CuSO4.5H20
0,01
0,00004
0,025
0,0001
0,025
0,0001
CoCl2.6H2O
-
-
0,025
0,0001
0,025
0,0001
0,01
0,000007
-
-
-
FeEDTA Na2EDTA.2H2O
37,3
0,1
*
0,05
FeSO4.7H2O
27,8
0,1
*
0,05
2,0 0,5 0,5 0,1 100 30.000
0,0266 0,004 0,0024 0,0003 0,55 87,6
1,0 1,0 10,0 100 20.000
0,008 0,0049 0,03 0,55 58,4
(NH4)2SO4 KNO3 CaCl2.2H2O MgSO4.7H2O
MnSO2.H2O
MoO3
Fe2(SO4)3
2,5
0,00625
Outros Glicina Ac. nicotínico Piridoxina-HCl Tiamina.HCl Mio-inositol Sacarose
3,0 0,5 0,1 0,1 -
0,04 4,1 0,05 0,03 -
3
Tabela 2. Composições de alguns meios de cultura, em mg/L (PieriK, 1987).
4 Tabela 3. Vitaminas mais comuns nos meios de cultura de vegetais e sua função metabólica. Nome Tiamina (B1) Piridoxina (B6) Ácido nicotínico
Função Coenzima do ciclo de Krebs, da fotossíntese, da biossíntese de aminoácidos, terpenóides, etc.; Coenzima de várias rotas metabólicas, incluindo biossíntese de aminoácidos e alcalóides; Coenzima de várias reações energéticas dependentes de luz, substrato para síntese de alcalóides;
Ácido ascórbico (C)
Antioxidante, protetor contra fenóis e substâncias redutoras;
Ácido fólico
Metabolismo lipídico;
Ácido pantotênico
Metabolismo lipídico;
Biotina
Metabolismo lipídico;
Tocoferol (E)
Antioxidante, também promove a quebra de lipídeos.
Tabela 4. Exemplos de reguladores de crescimento usados em cultura de tecidos de plantas. (Torres et al, 1998)
5
Tabela 5. Exemplo de soluções estoque para sais do meio MS, segundo Torres e Caldas (1990).
6 Tabela 6. Exemplo de solução estoque para sais do meio MS. Solução A B C
D E
F
Componente NH4NO3 KNO3 MgSO4.7H2O MnSO4.4H2O ZnSO4.7H2O CuSO4.5H2O CaCl2.2H2O KH2PO4 H3BO3 CoCl.6H2O KI Na2MoO4.2H2O Na2EDTA FeSO4.7H2O
Conc. sol. estoque (g/L)
Vol. para 1 L de meio (mL)
Conc. Meio (mg/L)
82,5 95,0 74,0 4,46 1,72 0,005 88,0 34,0 1,248 0,005 0,166 0,05 7,45 5,570
20 20
1.650 1.900 370 22,3 8,6 0,025 440 170 6,2 0,025 0,83 0,25 37,3 27,9
5
5
5
5
Tabela 7. Exemplos de soluções estoque de vitaminas e outros componentes do meio MS. Solução estoque
Concentração
Tiamina-HCl
0,5 mg/mL
Piridoxina-HCl
0,5 mg/mL
Ácido nicotínico
0,5 mg/mL
Glicina
0,5 mg/mL
mista (todas as vitaminas + glicina) Mio-inositol
1.000 x 100 mg/mL
Mio-inositol
50 mg/mL
Tabela 8. Exemplos de soluções estoque de hormônios. Substância
mg/100 mL
mg/mL
mM
AIA
8,76
0,088
0,5
ANA
9,31
0,093
0,5
2,4-D
11,05
0,111
0,5
KIN
10,75
0,107
0,5
6-BAP
11,25
0,113
0,5
7
I. Material 1. Soluções estoque: soluções salinas A a G, para formulação de Murashige e Skoog (1962) – MS vitaminas: tiamina, ácido nicotínico e piridoxina glicina mio-inositol reguladores de crescimento: AIA (ácido indol-acético) e BAP (benziladenina ou 6-benzilaminopurina) 2. Outros reagentes: ágar sacarose 3. Vidraria pipetas béqueres provetas erlenmeyers bastões de vidro
Exemplo de etiqueta:
II. Procedimento MSo
4. Adicionar as soluções de vitaminas, mioinositol e reguladores de crescimento. 5. Completar o volume até quase o volume total desejado utilizando proveta. 6. Ajustar o pH do meio para 5,7 ± 0,1 utilizando HCl ou KOH. 7. Completar com água deionizada ou destilada até o volume final. 8. Adicionar o ágar, no caso de meio sólido, e agitar com bastão de vidro. 9. Aquecer o meio no forno de microondas para dissolver o ágar. 10. Distribuir o meio nos recipientes indicados, etiquetá-los e fechá-los com tampas apropriadas ou papel alumínio: Tubos pequenos Tubos grandes Vidros grandes Vidros médios Vidros pequenos Placas de petri Erlenmeyers
10 mL 30 mL 50 mL 30 mL 20 mL 15 a 20 mL 50 mL
Observação: acondicionar o volume total dos meios a serem distribuídos em placas de petri em um vidro ou erlenmeyer. Embrulhar as placas vazias em papel próprio para serem autoclavadas. Posteriormente distribuir o meio nas placas já estéreis, em CFL.
1. Colocar em um béquer uma quantidade de água desionizada ou destilada de cerca de metade do volume final de meio a ser preparado. VER QUADRO 1. 2. Adicionar a sacarose. 3. Adicionar as soluções estoque do meio o básico, uma a uma. Usar as soluções A a G, 11. Autoclavar os recipientes a 121 C por 15 a 20 minutos. (Torres e Caldas, 1990), 10 mL de solução estoque por litro de meio de cultura.
01/01 1/01/09 /09
G3
Quadro 1. Meios de cultura a serem preparados. Meio Grupo
código
Número de recipientes
Volume / recipiente (mL)
Volume (mL)
MS sem hormônios
20 tubos
20
400
composição
1
MS0
2
MS1N
MS + 1 mg/L NAA
20 tubos
20
400
3
MS2B
MS + 2 mg/L BAP
20 tubos
20
400
4
MS1N2B
MS + 1 mg/L NAA + 2 mg/L BAP
20 tubos
20
400
