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Curso Técnico em Biotecnologia Cultura de Tecidos Vegetais
Estabelecimento de culturas in vitro de Saintpaulia ionantha Wendl. A violeta africana (família Gesneriaceae) é facilmente propagada de forma vegetativa, tanto in vivo quanto in vitro, As técnicas de cultura de tecidos podem ser úteis para o melhoramento genético desta cultura ou para a clonagem mais rápida do que a propagação convencional. Além disso, devido a seu alto potencial organogênico, protocolos de regeneração de brotos adventícios, de forma direta ou indireta (via calos), são facilmente aplicáveis. (Fonte: Daud et alli, 2008. Pak.J.Biol.Sci., 11(9):1240-1245)
A maior dificuldade da desinfestação é obter tecido descontaminado sem consuzi-lo à morte. Os pré-tratamentos aplicados na planta matriz podem ser determinantes para o sucesso desse processo. Várias substâncias germicidas são usadas para a desinfestação de explantes. As mais comuns são etanol e compostos a base de cloro, como hipoclorito de sódio ou cálcio. Outros agentes utilizados incluem o cloreto de mercúrio, ácido clorídrico, cloreto de benzalcônio e peróxido de hidrogênio. É comum adicionar detergente (ex.: Tween 20) às soluções germicidas para melhorar o contato com os tecidos. O etanol também é utilizado como surfactante e é comumente utilizado antes de outros germicidas. I. Material
** Lembre-se: uma tabela bem apresentada deve ser facilmente entendida. Isto é conseguido pela utilização de cabeçalhos autoexplicativos e, principalmente, pela organização dos dados nas linhas e colunas ("quem fica onde"). Nunca: liste os dados simplesmente, sem qualquer tipo de agrupamento mais apurado; deixe de colocar médias ou totais, o que for mais conveniente; deixe de anotar as legendas para símbolos ou abreviações.
1. Material Vegetal folhas de violeta (Saintpaulia ionantha Wendl.) 2. Soluções germicidas hipoclorito de sódio a 1% (ou água sanitária comercial , contendo ~5% de cloro livre, a 20%) 3. Material para manipulação asséptica (ver Protocolo “Preparo da câmara de fluxo laminar (CFL) para manipulação asséptica”) 4. 2 Béqueres de 1 L (1 para descarte) 5. Vidros contendo 20 mL de meio MS + 0,1mg/L NAA + 1mg/L BA (BAP)
2. Lavar as folhas na água com detergente por 5 min 3. Enxaguar bem em água corrente 4. Enxaguar 1 vez em água deionizada ou destilada 5. Em condições assépticas (CFL), prosseguir as lavagens como se segue: Hipoclorito de sódio (água sanitária) 10 min. (usar 3 volumes de solução germicida) Água destilada estéril - 3 a 4 lavagens (~1 min) 6. Com auxílio de pinça e bisturi, retirar a base dos pecíolos, esbranquiçada pelo tratamento anterior 7. Cortar o limbo foliar em segmentos de ~ 1 x 1 cm e os pecíolos em segmentos transversais de ~2 mm 8. Dispor 5 explantes/vidros Observações: no caso dos segmentos de limbo foliar tomar o cuidado de manter a superfície inferior (abaxial) em contato com o meio; fazer leve pressão sobre o meio de cultura ao posicionar os explantes, para garantir que estes se fixem na posição desejada. 9. Fechar os vidros com filme transparente de PVC 10. Etiquetar os vidros com o nome do vegetal (usar como código as iniciais do nome científico), meio de cultura, data e número do grupo (usar "G1", "G2", etc). 11. Incubar o material sob fotoperíodo de 16/8 h de luz e temperatura de 20 a 28OC Exemplo de etiqueta: Si MS NB
01/01/09 G3
II. Procedimento:
III. Resultados
Para explantes oriundos de campo realizam-se todas as etapas. Para explantes oriundos de casa de vegetação ou tratados com fungicidas ou outra substância germicida, o protocolo inicia-se na etapa 4. 1. Destacar folhas jovens e sadias, lavá-las sob água corrente e colocá-las em um béquer grande contendo água com 10 gotas de detergente
Acompanhe o desenvolvimento de suas culturas, avaliando a taxa de contaminação e o desenvolvimento do material. Esse desenvolvimento será medido pelo número (e porcentagem) de brotos e/ou raízes formados. Expresse seus resultados de maneira clara e objetiva (número total de frascos, percentagem de contaminação, etc.) e compare com os resultados obtidos pelos outros grupos.
