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Curso Técnico em Biotecnologia Cultura de Tecidos Vegetais
Estabelecimento de cultura de calos a partir de plântulas plântulas in vitro
Calos são aglomerados amorfos de células parenquimáticas, de paredes celulares finas, frouxamente arranjadas. Formam-se em virtualmente em todas as espécies vegetais como resposta a injúrias no caule ou na raiz. Esta é uma resposta de proteção da planta, em que a divisão celular é ativada como resultado da alteração do balanço hormonal endógeno. Os calos são iniciados in vitro sobre pequenos segmentos retirados da planta inteira (explantes) mantidos em meio de cultura indutor de crescimento, no qual os hormônios presentes alteram o metabolismo celular, levando-o de quiescente a ativo. Durante a formação do calo, a diferenciação e especialização celulares existentes na planta intacta são revertidas e o tecido do explante se torna desdiferenciado. Durante a desdiferenciação, substâncias de reserva desaparecem e novos meristemas surgem, produzindo células não diferenciadas, semelhantes a células parenquimáticas sem qualquer organização estrutural. A inexistência de organização persiste à medida que o calo cresce, embora durante o crescimento alguns tipos de células especializadas possam se formar aleatoriamente. Os calos aparentemente não têm padrão de organização, mas freqüentemente têm centros de atividade meristemática e regiões de câmbio rudimentar podem aparecer, com algumas áreas mostrando diferenciação vascular. Fonte: http://users.ugent.be/~pdebergh/cal/cal__d01.htm
II. Procedimento: 1. Registrar o material a ser repicado, anotando as seguintes informações: denominação do material número de recipientes número de plantas/recipiente meio de cultura data do repique anterior 2. Remover uma planta do frasco de cultura original e colocá-la sobre a placa de petri (diâmetro de 15 cm) 3. Com auxílio de pinça e bisturi ou tesoura, excisar as folhas cotiledonares e hipocótilos (VER DESENHO) 4. Cortar segmentos de hipocótilo de ~5 mm 5. Transferir os explantes (folhas cotiledonares inteiras e segmentos de hipocótilo) para os vidros contendo meio de cultura fresco, na densidade de 4 explantes/vidro 6. Etiquetar os vidros com o nome do vegetal (usar como código as iniciais do nome científico) e o tipo de explante (cotilédones ou hipocótilos)., meio de cultura, data e número do grupo 7. Incubar o material em câmara de crescimento com condições ambientais controladas: temperatura de 25oC ± 1oC, fotoperíodo de 16 h de luz e intensidade luminosa de cerca de 35 mE/s.
As culturas de calos são utilizadas para obtenção de variação somaclonal, obtenção de embriões somáticos ou para formação de inoculo inicial para culturas de células em suspensão. Nos protocolos de organogênse ou embriogênese indireta, uma fase de calo é III. Resultados obrigatória. Acompanhe o desenvolvimento de suas culturas semanalmente pela formação ou não I. Material de calos a partir dos explantes utilizados. 1. Material Vegetal Plântulas in vitro de brócolis (Brassica oleracea var. itálica Plenck.) 2. Material para manipulação asséptica (ver protocolo “Preparo da CFL para manipulação asséptica”) 3. Vidros médios contendo ~30 mL de meio MS + 1,0 mg/L NAA + 3,0 mg/L BAP
Antes de separar um frasco para ser repicado você deve se certificar de que não há contaminação do meio de cultura por fungos ou bactérias.
