O Básico- Rt-pcr - Thermo Fisher Scientific

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O Básico: RT-PCR por subbu Dharmaraj, MS RT-PCR (reacção em cadeia da polimerase de transcrição-reversa) é a técnica mais sensível para a detecção e quantificação de mRNA disponíveis no momento. Em comparação com as duas outras técnicas vulgarmente usadas para quantificar os níveis de mRNA, análise de Northern Blot e do ensaio de protecção de ARNase, RT-PCR pode ser utilizada para quantificar os níveis de mRNA a partir de amostras muito menor. Na verdade, esta técnica é sensível o bastante para permitir a quantificação de ARN a partir de uma única célula. Este artigo discute as vantagens da primeira em tempo real de RT-PCR em comparação com métodos de ponto final. Esta discussão é seguido por uma descrição dos diferentes métodos para a quantificação da expressão de genes por em tempo real de RT-PCR no que diz respeito aos diferentes produtos químicos disponíveis, os métodos de quantificação utilizados e as opções de instrumentação disponível. Posteriormente, os métodos "tradicionais" de expressão do gene a quantificação por RT-PCR, isto é, técnicas de ponto final, são apresentados. Links Rápidos Porque em tem po real de RT-PCR? Real-Tim e PCR Quím icas A quantificação dos resultados Instrum entação para Real-Tim e PCR Ferram entas para a Real-Tim e RT-PCR Ponto final RT-PCR: vs. Relativa Com petitiva vs. Com parativo Relativa de RT-PCR Com petição por RT-PCR RT-PCR com parativa Ferram entas para qualquer técnica de RT-PCR Porque em tempo real de RT-PCR? Ao longo dos últimos anos, o desenvolvimento de novos químicos e plataformas de instrumentação que permite a detecção de PCR , numa base de tempo real foi levado a adopção generalizada de tempo real de RT-PCR tal como o método de escolha para quantificar as alterações na expressão de genes. Além disso, em tempo real RT-PCR tornou-se o método preferido para a validação dos resultados obtidos a partir de matriz analisa e outras técnicas que avaliam as mudanças de expressão de genes em uma escala global. Para apreciar verdadeiramente os benefícios de PCR em tempo real, uma revisão dos fundamentos PCR é necessário. No início de uma reacção de PCR, são reagentes em excesso, do molde e do produto são em baixas concentrações suficientes que a renaturação do produto não compete com a ligação do iniciador e prossegue de amplificação, a uma taxa constante, exponencial. O ponto em que a taxa de reacção deixa de ser exponencial e entra numa fase linear de amplificação é extremamente variável, mesmo entre as amostras replicadas, mas parece ser principalmente devido a renaturação do produto competir com a ligação (iniciador uma vez que a adição de mais reagentes ou enzima tem pouca efeito). Em algum ciclo mais tarde, a taxa de amplificação cai para perto de zero (planaltos), e pouco mais produto é feito. Por motivos de exactidão e precisão, é necessário recolher dados quantitativos referentes a um ponto em que cada amostra é na fase exponencial de amplificação (já que é somente nesta fase que a amplificação é extremamente reprodutível). Análise de reacções durante a fase exponencial em um determinado número de ciclo deve, teoricamente, proporcionar várias ordens de grandeza de gama dinâmica. Alvos raras será provavelmente abaixo do limite de detecção, enquanto alvos abundantes será passado a fase exponencial. Na prática, uma gama dinâmica de 2-3 logs podem ser quantificado durante a-ponto de extremidade relativa de RT-PCR. A fim de alargar esta gama, replicar reacções podem ser realizadas por um maior ou menor número de ciclos, de modo que todas as amostras podem ser analisados na fase exponencial. -PCR em tempo real automatiza o processo de outra forma laboriosa quantificando produtos de reacção para cada amostra em cada ciclo. O resultado é uma surpreendentemente amplo alcance dinâmico 107 vezes, sem intervenção do usuário ou de repetições necessário. A análise dos dados, incluindo a geração de curva padrão e cálculo do número de cópias, é realizada automaticamente. Com um número crescente de laboratórios e instalações nucleares adquirindo a instrumentação necessária para análise em tempo real, esta técnica está se tornando a técnica de quantificação baseado em RT-PCR dominante. Topo Real-Time PCR Químicas Atualmente, quatro químicas diferentes, TaqMan ® (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), faróis moleculares, Scorpions® e SYBR® Verdes (Molecular Probes), estão disponíveis para PCR em tempo real. Todas estas químicas permitem a detecção de produtos de PCR por meio da geração de um sinal fluorescente. As sondas TaqMan, Beacons Moleculares e escorpiões depender de Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) para gerar o sinal de fluorescência por meio do acoplamento de uma molécula de corante fluorogénico e um inibidor moeity para os mesmos ou diferentes substratos de oligonucleótidos. SYBR Green é um corante fluorogénico que exibe pouca fluorescência quando em solução, mas emite um forte sinal de fluorescência após a ligação ao ADN de cadeia dupla. TaqMan Sondas As sondas TaqMan dependem da actividade de 5'-nuclease da polim erase de ADN utilizados para a PCR para hidrolisar um oligonucleótido que é hibridado com o fragmento amplificado alvo. As sondas TaqMan são oligonucleótidos que têm um corante repórter fluorescente ligado ao 'fim e um inibidor moeity acoplado ao terminal 3' 5 fim. Estas sondas são concebidas para hibridar com uma região interna de um produto de PCR. No estado não hibridada, a proximidade do flúor e as moléculas de atenuação evita a detecção do sinal fluorescente a partir da sonda. Durante a PCR, quando a polimerase de replica um modelo no qual uma sonda TaqMan está ligado, a 5'-nuclease de actividade das polimerase cliva a sonda. Este separa as fluorescentes e extinção de corantes e Desgaste já não ocorre. Assim, aumentos de fluorescência em cada ciclo, proporcional à quantidade de clivagem da sonda sondas TaqMan bem desenhados exigem muito pouco otimização. Além disso, elas podem ser utilizadas para ensaios multiplex através da concepção de cada sonda com um par Fluor / têmpera espectralmente distintos. No entanto, as sondas TaqMan podem ser caros de sintetizar, com uma sonda separada necessária para cada ARNm alvo a ser analisada. Beacons molecular Como sondas TaqMan, Molecular Beacons também usar FRET para detectar e quantificar o produto de PCR sintetizados através de um Fluor acoplado a 'e uma extremidade de arrefecimento rápido ligado à extremidade 3' da extremidade 5 de um substrato de oligonucleótido. Ao contrário de sondas TaqMan, Molecular Beacons são concebidos para permanecer intacto durante a reacção de amplificação, e deve religar para atingir em cada ciclo para medição de sinal. Beacons Molecular formar uma estrutura de haste-loop quando livre em solução. Assim, a proximidade do fluor e saciar moléculas impede a sonda fluorescente. Quando um farol molecular hibrida com um alvo, o corante fluorescente e o extintor são separados, se FRET não ocorrer, e o corante fluorescente emite luz após irradiação. Molecular Beacons, como sondas TaqMan, podem ser utilizadas para ensaios multiplex utilizando Fluor espectralmente separados / apagar porções de cada sonda. Tal como acontece com sondas TaqMan, Beacons Molecular pode ser caro para sintetizar, com uma sonda separada exigida para cada alvo. Scorpions Com sondas Scorpion, priming específico da sequência e detecção do produto de PCR é realizada utilizando um único oligonucleótido. A sonda Scorpion mantém uma configuração de haste-laço no estado não hibridizada. O fluoróforo está ligado à extremidade 5 'e é extinta por um radical acoplado à extremidade 3'. A porção 3 'da haste também contém uma sequência que é complementar à do produto da extensão do iniciador. Esta sequência está ligada à extremidade 5 'de um iniciador específico através de um monómero não amplificável. Depois de extensão do iniciador de escorpião, a sequência da sonda específica é capaz de se ligar ao seu complemento no interior do fragmento amplificado estendida abrindo assim a estrutura em gancho. Isso impede que a fluorescência a partir de se parar a reacção e um sinal é observada. SYBR Green SYBR Green fornece o formato mais simples e mais económico para a detecção e quantificação de produtos de PCR em reacções em tempo real. SYBR Green se liga ao ADN de cadeia dupla, e em consequência da excitação emite luz. Assim, como um produto de PCR se acumula, a fluorescência aumenta. As vantagens de SYBR Green são que é barato, fácil de utilizar, e sensível. A desvantagem é que SYBR Green irá ligar-se a qualquer ADN de cadeia dupla na reacção, incluindo dimeros de iniciadores e outros produtos de reacção não específicos, o que resulta em uma sobreavaliação da concentração de alvo. Para reações individuais de produtos de PCR com primers bem desenhados, SYBR Green pode funcionar muito bem, com espúria fundo não-específico apenas mostrando-se em ciclos muito tarde. SYBR Green é a opção mais econômica para a detecção de produto de PCR em tempo real. Uma vez que o corante liga-se a ADN de cadeia dupla, não há necessidade de conceber uma sonda para qualquer alvo particular a ser analisada. No entanto, a detecção por SYBR Green requer otimização extensa. Uma vez que o corante não consegue distinguir entre produto específico e não específico acumulada durante a PCR, ensaios de seguimento são necessários para validar os resultados. Repórteres em tempo real para Multiplex PCR As sondas TaqMan, Beacons Moleculares e escorpiões permitir que múltiplas espécies de DNA a ser medido na mesma amostra (PCR em multiplex), uma vez que os corantes fluorescentes com diferentes espectros de emissão pode ser ligado às diferentes sondas. Multiplex PCR permite controles internos para ser co-amplificados e autorizações alelo discriminação no single-tubo, ensaios homogêneos. Estas sondas de hibridação permitir um nível de discriminação impossível de obter com SYBR Green, uma vez que só irá hibridar com alvos verdadeiros numa PCR e não de dimeros de iniciadores ou outros produtos espúrios. Topo A quantificação dos resultados Duas estratégias são geralmente empregues para quantificar os resultados obtidos por em tempo real de RT-PCR; o método da curva padrão e o método comparativo de limiar. Estes são discutidos brevemente abaixo. Método curva padrão Neste método, uma primeira curva padrão é construído a partir de um ARN de concentração conhecida. Esta curva é então utilizado como um padrão de referência para a extrapolação de informações quantitativas para alvos de ARNm de concentrações desconhecidas. Embora possam ser utilizados padrões de ARN, a sua estabilidade pode ser uma fonte de variabilidade nas análises finais. Além disso, utilizando-se padrões de ARN iria envolver a construção de plasmídeos de ADNc que têm de ser transcrito in vitro para os padrões de RNA e quantificado precisamente, um processo demorado. No entanto, o uso de padrões de RNA absolutamente quantificados irá ajudar a gerar os dados de número de cópias absolutos. Além de ARN, outras amostras de ácidos nucleicos podem ser utilizados para construir a curva padrão, incluindo plasmídeo purificado dsDNA, gerado in vitro ADNcs ou qualquer amostra de cDNA expressando o gene alvo. Espectrofotometria a 260 nm pode ser usado para avaliar a concentração destes ADNs, que podem então ser convertidos para um valor de número de cópia com base no peso molecular da amostra usada. plasmídeos de ADNc são as normas preferidos para quantificação curva padrão. No entanto, uma vez que os plasmídeos de ADNc não irá controlar as variações de eficiência do passo de transcrição reversa, este método só se obter informação sobre as alterações relativas na expressão do mRNA. Este, e variação introduzida, devido à entrada de ARN variáveis, pode ser corrigido por normalização de um gene doméstico. Método Ct comparativa Outra abordagem é denominado quantificação do método Ct comparativa. Isto envolve a comparação dos valores do Ct de as amostras de interesse com um controlo ou calibrador tal como uma amostra não tratada ou de ARN a partir de tecido normal. Os valores do Ct de tanto o calibrador e as amostras de interesse são normalizados a um gene endógeno de limpeza apropriado. O método comparativo Ct é também conhecido como o 2- [delta] Método [delta] Ct, onde [delta] [delta] Ct = [delta] Ct, amostra - [delta] Ct, referência Aqui, [delta] CT, amostra é o valor Ct para qualquer amostra normalizada para o gene housekeeping endógeno e [delta] Ct, a referência é o valor Ct para o calibrador, também normalizada ao gene housekeeping endógeno. para o [delta] [delta] cálculo Ct para ser válido, as eficiências de amplificação do alvo ea referência endógena deve ser aproximadamente igual. Isto pode ser estabelecido olhando como [Delta] Ct varia de acordo com a diluição modelo. Se a trama de diluição cDNA contra delta Ct é próximo de zero, isso implica que os ganhos de eficiência dos genes-alvo e de limpeza são muito semelhantes. Se um gene de manutenção não pode ser encontrado, cuja eficiência de amplificação é semelhante ao alvo, então é preferido o método da curva padrão. Topo Instrumentação para Real-Time PCR PCR em tempo real requer uma plataforma de instrumentação que consiste de um term ociclador , um computador, ópticas para a excitação de fluorescência e de recolha de emissão, e a aquisição de dados e softw are de análise. Estas máquinas, disponíveis de vários fabricantes, diferem na capacidade de amostra (alguns são de 96 poços formato padrão, outros processar menos amostras ou exigir tubos capilares de vidro especializados), método de excitação (alguns usam lasers, outras grandes fontes de luz de espectro com filtros ajustáveis) e sensibilidade global. Há também diferenças específicas da plataforma na forma como os dados de processos de softw are. Máquinas de PCR em tempo real não são baratos, atualmente cerca de US $ 25K - $ 95K, mas estão bem dentro de compra alcance das instalações nucleares ou laboratórios que têm a necessidade de uma análise quantitativa de alto rendimento. Para obter uma lista abrangente de tempo real termocicladores consulte o w eblink no final deste artigo. Topo Ferramentas para a Real-Time RT-PCR Da Ambion Kit MessageSensor ™ RT inclui uma RNase H + MMLV RT que supera claramente as enzimas MMLV RT que aboliram a atividade RNase H em tempo real experiências de RT-PCR. Ao contrário de muitos outros kits de qRT-PCR, MessageSensor inclui um controlo de RNA total, um controlo de GAPDH humano conjunto de iniciadores, inibidor de RNase, e nucleótidos, assim como um aditivo tampão que permite a detecção com o corante verde SYBR ®. O Células-a-cDNA ™ Kit II produz ADNc a partir de células de mamífero cultivadas em menos de 2 horas. Sem isolamento de ARN é necessária. Este kit é ideal para aqueles que querem realizar reações de transcrição reversa em um pequeno número de células, amostras de células numerosos, ou para os cientistas que não estão familiarizados com o isolamento do RNA. Kit Células-to-cDNA II da Ambion contém um romance celular Tampão de Lise que inativa RNases endógenos sem comprometer reações enzimáticas a jusante. Após inactivação de ARNases, o ligado celular pode ser directamente adicionado a uma reacção de síntese de cDNA. Células-a-ADNc II é compatível com um passo e de dois passos em tempo real protocolos de RT-PCR. Contaminação com ADN genómico pode levar a resultados falsos positivos de RT-PCR. Ambion oferece uma variedade de ferramentas para eliminar a contaminação de ADN genómico a partir de amostras de ARN antes da RT-PCR. Da Ambion ™ Reagentes ADNase tratam ento, elim inação isentos de ADN foram concebidos para a remoção de contaminantes de ADN a partir de amostras de ARN e para a remoção da ADNase após o tratamento, sem tratamento de proteinase K e extracção orgânica. Além disso, também tem desenvolvido Ambion TURBO ™ ADNase , uma enzima hiperactivo engenharia de ADNase bovina do tipo selvagem. A competência de TURBO ADNase na ligação de concentrações muito baixas de ADN significa que a enzima é particularmente eficaz na remoção de pequenas quantidades de contaminação de ADN. Ambion agora também oferece uma alternativa económica para o elevado custo dos reagentes de PCR para o tubo ABI 7700 e outros 0,2 ml instrumentos em tempo real baseados. SuperTaq ™ em tempo real um desempenho tão bom ou melhor do que as alternativas mais caras, e inclui os dNTP e um tampão de reacção optimizados para SYBR Green, TaqMan, e químicas Beacon Molecular. Topo Ponto final RT-PCR: vs. Relativa Competitiva vs. Comparativo Apesar dos rápidos avanços feitos na área de real-time PCR químicas detecção e instrumentação, end-point RT-PCR continua a ser uma técnica muito comumente usado para medir mudanças no gene-expressão em pequeno número de amostras. End-point RT- a PCR pode ser utilizado para medir alterações nos níveis de expressão usando três métodos diferentes: relativos, competitivos e comparativos. Os procedimentos mais usados para a quantificação ponto final resultados de RT-PCR confiar na detecção de um corante fluorescente, tal como brometo de etídio, ou quantificação do produto de PCR marcado com P32 por um Phosphorimager ou, em menor extensão, por contagem de cintilação. Quantificação relativa compara abundância transcrição em várias amostras, usando um controle interno co-amplificada para a normalização da amostra. Os resultados são expressos como proporções do sinal específico para o gene para o sinal de controlo interno. Isto produz um valor corrigido em relação ao produto específico do gene em cada amostra. Estes valores podem ser comparados entre as amostras para uma estimativa da expressão relativa de ARN alvo nas amostras; por exemplo, 2,5 vezes mais IL-12 na amostra do que 2 na amostra 1. quantificação absoluta, utilizando competidor de RT-PCR, mede a quantidade absoluta (por exemplo, 5,3 x 105 cópias) de uma sequência de mRNA específico na amostra. Diluições de um ARN sintéticos (idênticos na sequência, mas ligeiramente mais curtos do que o alvo endógeno) são adicionadas a amostras de ARN replica e são co-amplificadas com o alvo endógeno. O produto de PCR do transcrito endógeno é depois comparado com a curva de concentração criado pelo sintético "ARN competidor." Imita comparativa de RT-PCR competitiva de RT-PCR, em que a mensagem de destino a partir de cada amostra de ARN concorre para reagentes de amplificação dentro de uma única reacção, tornando a técnica quantitativa de forma fiável. Uma vez que o cDNA a partir de ambas as amostras têm o mesmo local de ligação do iniciador de PCR, uma amostra actua como um competidor para o outro, tornando-se desnecessário, para sintetizar uma sequência de ARN competidor. Ambas as técnicas relativas e competitivos de RT-PCR de quantificação requerem experiências piloto. No caso da relação de RT-PCR, experiências piloto incluem a selecção de um método de quantificação e de determinação da gama de amplificação exponencial para cada ARNm em estudo. Para competitivo de RT-PCR, um ARN transcrito de competidor sintético deve ser sintetizados e utilizados em experiências piloto para determinar a gama apropriada para a curva padrão. Comparativo RT-PCR fornece sensibilidade semelhante como RT-PCR relativa e competitiva, mas requer significativamente menos optimização e não requer a síntese de um concorrente. Topo Relativa de RT-PCR Relativa de RT-PCR utiliza iniciadores para um controlo interno que são multiplexados na mesma reacção de RT-PCR com os iniciadores específicos de gene. O controlo interno e iniciadores específicos para o gene deve ser compatível - isto é, eles não devem produzir bandas adicionais ou hibridam uma com a outra. A expressão do controlo interno deve ser constante em todas as amostras a ser analisadas. Em seguida, o sinal do controlo interno pode ser usada para normalizar os dados de amostra para explicar as diferenças tubo-a-tubo causados pela qualidade variável ARN ou eficiência RT, quantificação imprecisa ou pipetagem. Controles internos comuns incluem ß-actina e GAPDH mRNAs e 18S rRNA. Ao contrário northerns e protecção nuclease ensaios, em que uma sonda de controlo interno é simplesmente adicionado ao experimento, o uso de controles internos em relação RT-PCR requer otimização substancial. Para os dados relativos RT-PCR para ser significativo, a reação de PCR deve ser encerrada quando os produtos de ambos o controlo interno e o gene de interesse são detectáveis e estão a ser amplificado dentro de fase exponencial (ver Determinação exponencial na Faixa de PCR). Porque RNAs de controlo interno são tipicamente constitutivamente expressa genes de limpeza de alta abundância, a sua amplificação supera fase exponencial com muito poucos ciclos de PCR. Por conseguinte, é difícil identificar condições compatíveis fase exponencial em que o produto de PCR a partir de uma mensagem rara é detectável. Métodos de detecção com baixa sensibilidade, como brometo de etídio de géis de agarose, portanto, não são recomendados. Detecção de uma mensagem rara enquanto permanecer na gama exponencial com uma mensagem abundante pode ser conseguido de várias maneiras: 1), aumentando a sensibilidade da detecção do produto, 2), diminuindo a quantidade de molde de entrada nas reacções de RT ou de PCR e / ou 3) por diminuindo o número de ciclos de PCR. Ambion recomenda a utilização de rRNA 18S como um controlo interno, dado que apresenta menor variação na expressão entre as condições de tratamento de ß-actina e GAPDH. No entanto, por causa da sua abundância, é difícil detectar o produto de PCR para mensagens raras na fase exponencial de amplificação de rRNA 18S. Patenteada tecnologia Competimer ™ da Ambion resolve este problema por meio da atenuação do sinal de 18S ARNr, mesmo ao nível de mensagens raras. Atenuação resultados do uso de competimers - iniciadores idênticos em sequência ao funcionais 18S rRNA iniciadores mas que estão "bloqueados" na sua extremidade 3 'e, portanto, não pode ser alargado por PCR. Competimers e iniciadores são misturados em várias proporções para reduzir a quantidade de produto de PCR gerado a partir do ARNr 18S. A Figura 1 ilustra que os iniciadores de ARNr 18S sem competimers não pode ser usado como um controlo interno devido a amplificação de rRNA 18S que supera de clatrina (comparar os painéis A e B). A mistura de iniciadores com competimers na proporção de 3: 7 atenua o sinal de 18S ARNr, tornando 18S rRNA um controlo interno prático (painel C). Figura 1. Tecnologia ™ Quantum RNA de Am bion no Multiplex RT-PCR quantitativo utilizando 18S rRNA com o um controlo interno. reações de RT-PCR no cérebro, embrião, fígado e baço RNA total usando) iniciadores A para clatrina, B) iniciadores para primers clatrina e 18S, ou C) para clatrina, primers 18S rRNA e 18S rRNA Competimers. Note-se que, sem Competimers, 18S não pode ser usado como um controlo interno por causa de sua alta abundância (B). A adição de Competimers (C) faz PCR multiplex possível, fornecendo amostra-a-amostra quantificação relativa. Da Ambion Quantum RNA 18S padrões internos conter 18S rRNA iniciadores e competimers desenhados para amplificar 18S ARNr em todos os eucariotas. Os Universal 18S padrões internos funcionar em toda a gama mais ampla de organismos, incluindo plantas, animais e muitos protozoários. O clássico I e II clássico 18S padrões internos podem ser usados com qualquer amostra de RNA de vertebrados. Todos os padrões internos 18S funcionam bem em RT-PCR multiplex. Estes kits incluem ARN de controlo e manual de instruções detalhando a série de experiências necessárias para tornar significativo dados relativos de RT-PCR. Para os pesquisadores que tenham validado ß-actina como um controlo interno apropriado para o seu sistema, os ß-actina padrões internos Quantum RNA estão disponíveis. Topo Competição por RT-PCR Competição por RT-PCR quantifica precisamente uma mensagem por RT-PCR comparando a intensidade do sinal do produto para uma curva de concentração gerado por uma sequência de ARN competidor sintético. O transcrito de ARN competidor é concebido para a amplificação por os mesmos iniciadores e com a mesma eficiência que o alvo endógeno. O competidor produz um produto diferente em tamanho para que possa ser distinguido do produto alvo endógeno por análise em gel. O competidor é cuidadosamente quantificada e titulada em amostras de RNA replicadas. Experiências piloto são utilizados para encontrar o intervalo de concentração de competidor em que o sinal experimental é mais semelhante. Finalmente, a massa de produto nas amostras experimentais é comparada com a curva para determinar a quantidade de um RNA específico presente na amostra. Alguns protocolos usam concorrentes de ADN ou sequências aleatórias para competitiva de RT-PCR. Estes concorrentes não controlam eficazmente as variações na reacção de RT e para a eficiência de amplificação da sequência experimental específico, como o fazem os concorrentes de ARN. Topo RT-PCR comparativa Enquanto os métodos extremamente sensível, ambos relativos e competitivas de qRT-PCR têm desvantagens. Relativa de RT-PCR requer optimização extensiva para assegurar que a PCR é terminada quando tanto o gene de interesse e um controlo interno são na fase exponencial da amplificação. Competitiva de RT-PCR que requer um "concorrente" exógeno ser sintetizados para cada alvo a ser analisada. No entanto, comparativa de RT-PCR atinge o mesmo nível de sensibilidade, estes métodos padrão de qRT-PCR, com significativamente menos optimização. mRNAs alvo a partir de 2 amostras foram testadas simultaneamente, cada um servindo como um competidor para o outro, tornando-se possível comparar a abundância relativa do alvo entre amostras. Comparativo RT-PCR é ideal para a análise de genes alvo descobertas pelos métodos de rastreio tais como análise de arranjo e de apresentação diferencial. Topo Ferramentas para qualquer técnica de RT-PCR Se você optar por executar em tempo real, parente, competitiva ou comparativa RT-PCR, oferecemos produtos para simplificar suas experiências de RT-PCR e tornar os dados mais quantitativos. Em adição aos produtos específicos descritos acima, que oferecem superTaq polim erase ™ , M-MLV Reverse Transcriptase , e tubos de PCR livres de RNase . Para evitar a contaminação cruzada durante as experiências de PCR, também oferecemos DNAZap ™ Solution DNA Degradação e pontas de pipeta de barreira RNase . Para uma lista completa de publicações que discutem praticamente todos os aspectos de tempo real RT-PCR visite w w w .w zw .tum .de /gene-quantification/real-tim e.htm l Topo Informações sobre pedidos Catálogo # Nom e Tam anho Preço de (BRL) AM1906 DNA- livre ™ Kit Rem oção DNA 50 reacções 536,75 AM2054 SuperTaq ™ Além disso polim erase (clonado) 5 U / m L 50 unidades 407,31 AM9890 ADN Zap ™ PCR Soluções de ADN de degradação 250 ml 419,19 AM1914 Kit de Isolam ento RNAqueous®-se o ARN total 4PCR 30 preps 1,026.00 AM1717 Quantu m RNA ™ Classic II 18S padrão interno 100 reacções Nos contate > AM1718 Quantu ARNm ™ 18S Universal Padrão Interno 100 reacções 945,25 AM1710 Kit RETROscript® Transcrição Reversa 40 reacções 1,486.75 Qtde - AM12225 De parede fina, a tam pa fosco, tubos de PCR livre de RNase (0,2 m L) 1000 tubos 693,50 AM1720 Quantu ARNm de p-actina ™ padrões internos 100 reacções Nos contate > AM2238 ADNase TURBO ™ (2 U / m L) 1000 unidades 489,25 AM1722 Kit de células-a-cDNA ™ II 40 reacções 2,137.50 AM12640 Barreira (Filter) Dicas, tam anho 10 m L (com patível com pipetas Pipetm an ™) 10 prateleiras 817,00 AM1745 Kit MessageSensor ™ RT 50 reacções Nos contate > AM12230 PCR Tubos & Caps, RNase, 0,2 m L (8-strip form at) 125 tiras 812,25 AM1716 Quantu m RNA ™ clássico 18S padrão interno 100 reacções 969,00 AM12635 Barreira (Filter) Dicas, tam anho 10 m L (com patível com pipetas Eppendorf®) 10 prateleiras 788,50 AM2043 M-MLV da Transcriptase Reversa (100 U / uL) 4000 unidades 503,50 - - Adicionar ao cartão © 2016 Thermo Fisher Scientific Inc. 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