Manipulação Asséptica

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INTRODUÇÃO Antes de iniciarmos este relatório, nada melhor do que abordar, mesmo que de forma pouco abrangente, alguns assuntos e temas que estarão presentes no mesmo, no qual são importantes para um melhor entendimento. Bactérias Conhecidas como um dos microrganismos mais antigos há habitar o planeta Terra as bactérias são caracterizadas por serem procarióticas (sem carioteca) e serem unicelulares, apesar de formaram colônias, que nada mais são do que agrupamento de células. São seres invisíveis a olho nu. Apesar de geralmente estarem ligadas a doenças contagiosas as bactérias podem ser aplicadas no desenvolvimento da Indústria de alimentos, na ecologia, ou até mesmo na saúde humana. Fungos Os fungos formam um grupo muito numeroso, com cerca de 20.000 espécies encontradas em qualquer tipo de ambiente. Podem ser macroscópicos ou até microscópicos unicelulares e todos são heterotróficos. Assim como as bactérias, os fungos são importantes agentes recicladores de nutrientes na Biosfera terrestre, esse sua atividade decompositora, muitas vezes é prejudicial ao homem, que acaba perdendo alimentos, roupas, entre outras. Cabe ao homem proteger-se, mantendo o que se quer preservar em ambiente seco, visto que, umidade e matéria orgânica são essenciais para a sobrevivência dos fungos. Os fungos podem se reproduzir por brotamento, fissão ou por meio de esporos. Importância da prática de manipulação asséptica na análise microbiológica Em qualquer ambiente estamos expostos a microrganismos. No laboratório microbiológico, esses microrganismos se não forem reduzidos, podem afetar negativamente os experimentos realizados alterando o resultado esperado no decorrer da prática. E para isso a técnica de manipulação asséptica é de grande importância para manter os meios de cultura ou matérias estéreis isentos de contaminação. O ambiente de trabalho deve estar o mais livre possível de microrganismos para se obter bons resultados. O manuseio de microrganismos Ao manusear material biológico ocorre o risco do contágio com várias doenças por conta de agentes patogênicos causadores dessas. Esses riscos são medidos em função do poder patogênico do agente infeccioso, da sua resistência no meio ambiente, do modo de contaminação, da importância da contaminação (dose), do estado de imunidade do manipulador e da possibilidade de tratamento preventivo e curativo eficazes. Assim são divididos em 4 classes de risco para que quando for se manipular determinado agente de uma classe, os cuidados devidos sejam tomados de acordo com a classe. As principais vias envolvidas num processo de contaminação biológica são a via cutânea ou percutânea (com ou sem lesões - por acidente com agulhas e vidraria, na experimentação animal - arranhões e mordidas), a via respiratória (aerossóis), a via conjuntiva e a via oral, por isso faz-se necessário o uso de Epi´s para evitar a contaminação por essas vias. IDENTIFICAÇÃO DE MICROORGANISMOS Nos dedos da mão do manipulador Lista de Materiais utilizados - duas Placas de Petri contendo meio de cultura para bactérias (Plate Count Agar) - lamparina - papel Kraft - papel toalha - álcool 70% Lista de Equipamentos - estufa Metodologia Escolheu-se um dos membros da equipe para não lavar as mãos ao entrar no laboratório para realizar a prática descrita abaixo. Perto da lamparina, pressionou-se 3 dedos em uma placa de Petri contendo meio de cultura PCA para a bactéria. Feito isso, as mãos do mesmo integrante do grupo foram higienizadas com água e sabão, secadas com papel toalha, e em seguida aplicou-se álcool 70 por cento. Após a evaporação do álcool nas mãos, repetiu-se o mesmo procedimento descrito acima. As placas com os dedos sujos e limpos foram identificadas, embrulhadas com papel Kraft e incubadas invertidas numa estufa por 48 horas a 37,0 ºC com variação de aproximadamente de 0,5°C. No ambiente de trabalho Lista de Materiais utilizados - uma placa de petri com meio de cultura para bactérias (PCA) - uma placa com meio de cultura para fungos. - Papel Kraft Lista de Equipamentos - estufa Metodologia Inicialmente, foram expostas duas placas de petri , uma contendo meio de cultura para bactérias(PCA) e outra contendo meio de cultura para fungos (PDA ou Sabouraud). Estas foram colocadas sobre castelo da segunda bancada esquerda, próximo ao lava-olhos. A exposição durou em média quinze minutos (decorridos das dez horas e quarenta às dez horas e cinquenta e cinco minutos da manhã). As placas foram fechadas, embrulhadas com papel Kraft e logo após, incubadas de modo invertido. A placa com meio para fungos foi encubada numa estufa durante quatro dias a 25,0°C e a placa com meio para bactéria numa outra estufa por um período de 48 horas a 37,0°C com variação de 0,5°C aproximadamente nos dois casos. Em materiais não estéreis Lista de Materiais utilizados - dois erlenmeyers não estéreis - dois tubos de ensaio com solução de enxágue estéril - algodão hidrófilo - lamparina - duas pipetas estéreis - duas placas de Petri - dois tubos de ensaio contendo meio de cultura fundido para bactérias (NA) - estante para tubos de ensaio Lista de Equipamentos - auxiliar de pipetagem - estufa Metodologia Antes de iniciar a prática, todos os membros do grupo estavam com as mãos devidamente higienizadas e aptos para a efetivação da mesma. O método que será descrito abaixo foi feito duas vezes por dois membros da equipe utilizando vidrarias diferentes. Consequentemente, se obterá dois resultados distintos. Acendeu-se a chama e pegou-se uma vidraria não estéril no laboratório: erlenmeyer. Feito isso, utilizou-se um tubo de ensaio contendo 20 mL de solução de enxágüe estéril, com um pedaço de algodão hidrofóbico em sua extremidade aberta, e transferiu-se a solução em questão para o erlenmeyer, lembrando que o algodão deve ser retirado com cuidado e a "boca" do tubo deve ser flambada na chama antes da transferência. Colocou-se o algodão de volta no tubo e o tubo na estante. Concluída esta etapa, homogenizou-se a solução na vidraria em análise (não esquecendo que todas as etapas para a realização desta prática foram feitas o mais próximas da chama possível) para arrastar os microrganismos de suas paredes. Pegou-se uma pipeta estéril que estava envolta por papel Kraft e retirou-se um pedaço do papel que cobria apenas o ponto da pipeta em ela deveria ser acoplada a um auxiliar de pipetagem, para que só assim, todo o papel que a envolvia fosse retirado. Foi retirado com a pipeta 1 mL da solução contida no erlenmeyer e foi transferido para a placa de Petri. Um outro tubo de ensaio, que estava em banho maria, com um pedaço de algodão em sua extremidade aberta, contendo 20 mL de meio de cultura para bactérias, foi utilizado para a transferir o mesmo para a placa de Petri. O procedimento se deu de forma parecida com o descrito anteriormente neste mesmo tópico: retirou-se o algodão, flambou-se a "boca" do tubo de ensaio e fez-se a transferência do meio de cultura ainda em estado liquido para a placa na qual continha a alíquota da solução de enxágue estéril proveniente do erlenmeyer que estamos analisando. Uma observação importante a ser feita é que o meio de cultura não pode ser colocado muito quente na placa, pois pode acarretar na morte dos microrganismos, mas também tem que se ter o cuidado de não colocá-lo frio (abaixo de 50°C aproximadamente), pois ele pode se solidificar e acontecendo isso, invalidará a nossa prática. Feito isso, a placa foi fechada cuidadosamente e foram feitos movimentos em formas de oito lentamente sobre a bancada. Terminada esta fase, observou-se o meio se solidificar na placa, embrulhou- a com papel Kraft e colocou-a de forma invertida na estufa a mais ou menos 35°C (com variação de 0,5°C) e deixou-as encubadas por um período de 48 horas. Obs: todas as análises foram feitas na segunda bancada do lado esquerdo do laboratório 14. Antes da inicialização das práticas, as bancadas foram devidamente desinfectadas com álcool 70% utilizando algodão hidrófilo. RESULTADOS Análise das mãos do manipulador Na análise feita com os dedos da mão do manipulador encontramos incontáveis UFC/placa (obs: numa placa de 100 ml de diâmetro, se o resultado obtido for acima de 300 UFC, considera-se como incontável) antes de ser feita a higienização e 65 UFC/placa após a higienização realizada. Nas duas placas as colônias se mostraram com aspecto esférico e esbranquiçado. Análise do ambiente de trabalho Na análise do ambiente encontramos para bactérias 32 UFC/placa/15 min com aspecto esférico e amarelado. Já para os fungos, o resultado obtido foi de 27 UFC/placa/15 min com formato esférico e de cor branca, algumas com aparência aveludada, um indicador de fungos filamentosos, e outras de aspecto leitoso, onde provavelmente possam ser leveduras. Análise das vidrarias não-estéreis Na análise dos materiais não estéreis do laboratório 4 UFC/mL foram encontradas no primeiro erlenmeyer analisado. Já no segundo, 201 UFC/mL foram encontradas. Em ambos, as colônias se formaram como pequenas esferas esbranquiçadas. CONCLUSÕES Ao observar os nossos resultados, podemos concluir que a má ou a não higienização de um manipulador ou de um equipamento pode interferir de modo quantitativo e qualitativo na análise microbiológica. Após analisados os resultados, fica clara a importância da higienização de seu local de trabalho, das pessoas que vão realizá-lo e da prática correta dos procedimentos a serem realizados na análise, para que assim se tenha uma maior confiabilidade nos resultados. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS UZANIAN, Armênio; BIRNER, Ernesto. Biologia 2. 2 ed. Editora Harbra. http://pt.wikipedia.org/wiki/Bactéria, acesso em 24/04/2010. Revista Super Interessante, nº 268, agosto de 2009 http://www.fiocruz.br/biosseguranca/Bis/lab_virtual/riscos_biologicos.html, acesso em 26/04/2010 PELCZAR, Michael; KRING, Noel R.; CHAN, E.C.S. Microbiologia: conceitos e aplicações. Vol. 01. 2ª ed. São Paulo, SP, Makron Books, 1996, 524 p. http://recife.ifpe.edu.br/ManipAsseptica.pdf, acesso em 24/04/2010.