Extração Dna Morango (1)

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AULA PRÁTICA 1: EXTRAÇÃO DE DNA DE MORANGO (Fragaria ananassa – ROSACEAE) Os morangos que consumimos hoje são resultado de cruzamentos de espécies diferentes que ocorriam naturalmente na Europa (França e Rússia) e nas Américas (Chile e Estados Unidos). Prestam-se muito bem para a extração de DNA porque são fáceis de serem macerados e quando maduros produzem pectinases e celulases, que são respectivamente as enzimas que degradam os reforços celulares de pectina e a celulose. Além disso, os morangos atuais são octaplóides, ou seja, possuem 8 genomas! MATERIAL NECESSÁRIO: Morangos maduros Saco plástico resistente Tubo de ensaio Filtro de papel (destes usados para coar café) com a base Detergente doméstico Sal de cozinha Álcool gelado (colocado no congelador por 1 noite) Bastão de vidro Água morna (70o – 75o C) PROCEDIMENTO Colocam-se 2 a 3 morangos em um saco plástico, umas 5 gotas de detergente, uma pitada de sal de cozinha e um pouco de água morna. Macera-se tudo e filtra-se. Coloca-se sobre o filtrado o mesmo volume de álcool gelado, com cuidado para que forme uma fase sobre o filtrado. Aguarda-se um pouco e observa-se o DNA saindo do filtrado e passando para a fase do álcool. Com o auxílio do bastão de vidro, fazendo-se movimentos giratórios, pode-se "pescar" os filamentos que são as moléculas de DNA. PERGUNTAS PARA FIXAÇÃO DO ASSUNTO DE AULA EXTRAÇÃO DE DNA: Data: .............................. Aluno:...................................................................... ......................................... Pergunta 1: Qual a função de cada regente usado na extração simplificada do DNA explanada nesta aula prática? Do sal Do detergente Do álcool Pergunta 2: O que se consegue ver seria o DNA puro? Pergunta 3: Como se sabe que os filamentos são moléculas de DNA? Pergunta 4: Se fosse RNA seria possível enrolá-lo como foi feito para o DNA? Porque? Tópicos para discussão 1. Sobre as estruturas celulares e qual a sua composição As membranas, celular e nuclear são compostas principalmente por lipídeos. As proteínas encontram-se aprisionadas na bicamada lipídica. Os organismos celulares são compostos por proteínas, ácidos nucléicos (DNA e RNA), envolvidos por uma membrana. As paredes celulares das células vegetais são compostas essencialmente por polissacarídeos. As pequenas estruturas celulares são compostas por substâncias com diferentes propriedades químicas, pelo que os procedimentos experimentais devem ser definidos de modo a separar um determinado constituinte celular das restantes partes, sem causar muitos danos. 2. Onde se encontra o DNA na célula Cerca de 99% do DNA encontra-se no núcleo da célula, o restante encontra-se em locais específicos como exemplo, nas organelas (mitocôndria e os cloroplastos possuem o seu próprio DNA). Apesar dessas organelas terem o seu próprio cromossomo elas não podem contar somente com a sua informação contida neles, elas necessitam de genes especiais situados em noutras organelas e, na maioria dos casos, nos cromossomos nucleares. 3. Sobre a função dos reagentes usados na experiência 3.1. Sal A adição do sal (NaCl) no início da experiência proporciona ao DNA um ambiente favorável. O sal contribui com íons positivos e negativos. Os positivos neutralizam a carga negativa do DNA, e os negativos as histonas, permitindo que o complexo DNA+Histonas não se repila mais e então se enovele. Se não fosse a presença do sal, ele poderia desintegra-se. Um outro fato, é que o sal aumenta a densidade do meio, o que facilita a migração do DNA para o álcool. 3.2. Detergente O detergente afeta a permeabilidade das membranas, que são constituídas, em parte, por lipídeos. Com a ruptura das membranas os conteúdos celulares, incluindo as proteínas e o DNA, são liberados e dispersam-se na solução. A função de algumas dessas proteínas é manter o DNA enrolado numa espiral muito apertada. 3.3. Álcool O DNA não se dissolve no álcool. Como resultado, o DNA precipita-se. Ele aparece à superfície da solução porque é menos denso que a água e a mistura aquosa dos restos celulares. 4. Como se sabe que os filamentos são moléculas de DNA? Porque, a partir de estudos das propriedades químicas dos filamentos sabe- se que estes têm as mesmas propriedades das moléculas de DNA. Por exemplo, o RNA não se enrolaria no palito, o DNA não é solúvel em álcool, é menos denso que a água, tem grande absorção de luz UV, quando corado com brometo de etídio mostra-se fluorescente em luz UV.