Estrutura Tridimensional Das Proteínas

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Profa. Ana Paula Salerno IFRJ- Coordenação de Biotecnologia Estrutura Tridimensional das Proteínas PROTEÍNAS: protos (grego) = primeiro  Moléculas complexas e funcionalmente sofisticadas  Uma macromoléculas resultantes da condensação de moléculas de aminoácidos através de ligações peptídicas  Possuem pesos moleculares variados A importância das proteínas, entretanto, está relacionada com suas funções no organismo, e não com sua quantidade Muitas vezes, as enzimas existem em porções muito pequenas. Mesmo assim, estas substâncias catalisam todas as reações metabólicas e capacitam aos organismos a construção de outras moléculas - proteínas, ácidos nucléicos, carboidratos e lipídios - que são necessárias para a vida. O que distingue uma proteína de outra é o seu número de aminoácidos, o tipo de aminoácidos que elas possuem, e a sequência que estão ligados. Enzimas Estrutural Regulatória Contrátil Funções das Proteínas Defesa Transporte Estruturas de Proteínas  Primária  Secundária  Terciária  Quaternária Estrutura primária • É a sequência linear de aminoácidos em uma cadeia polipeptídica, formada através de ligações covalentes (peptídicas). • 1953 Frederick Sanger determinou a estrutura primária da insulina. Esse estudo mostrou que as proteínas têm uma sequência de aminoácidos definida. • Sua estrutura é somente a seqüência dos aminoácidos, sem se preocupar com a orientação espacial da molécula. Estudos mostraram que a sequência de aminoácidos de uma proteína é geneticamente determinada. A estrutura primária de uma proteína é destruída por hidrólise química ou enzimática das ligações peptídicas, com liberação de peptídeos menores e aminoácidos livres. Porém, a estrutura da proteína funcional depende diretamente da sequência de aminoácidos na estrutura primária da proteína. Estrutura Secundária Refere-se a arranjos particularmente estáveis dos resíduos de aminoácidos dando origem a certos padrões estruturais. Esses arranjos são mantidos principalmente por pontes de hidrogênio e outras interações fracas. A estrutura do tipo -hélice foi prevista em 1951 por Linus Pauling e Corey. A primeira hélice só foi vista 6 anos mais tarde quando se determinou a estrutura da mioglobina. A estrutura secundária é mantida por pontes de hidrogênio. São relativamente fracas (1-3 kcal/mol). O átomo de H é parcialmente compartilhado por dois átomos relativamente eletronegativos, como o O e o N. D O N — H ......... N dd+ dN — H ......... O A D C E P O — H ........ N O R A T O O — H ......... O R Estudos da estrutura tridimensional de proteínas tiveram grande impulso na década de 1950 com Linus Pauling, e o uso de raios-X para analisar cristais de proteína. Na queratina (lã de carneiro), Pauling viu um padrão repetitivo de zonas claras (eletrondensas) e escuras na difração de raios X. Raio X Para explicar esse padrão, foi proposto o modelo da -hélice, com as seguintes características: • esqueleto covalente C-C-N-C-C-N da proteína assume a forma de espiral ou mola, enrolada para a direita, com um espaçamento de 3,6 resíduos de aminoácido por volta; Filme fotográfico • o enovelamento é estabilizado por pontes de hidrogênio entre átomos das ligações peptídicas de qualquer aminoácido, exceto prolina; -hélice • as cadeias laterais dos aminoácidos voltam-se para fora da hélice. Linus Pauling também propôs o modelo da folha pregueada ou estrutura b para explicar o padrão de difração de raios X pela b-queratina, proteína presente na unha, chifres e cascos de animais. Na folha pregueada as cadeias polipeptídicas dispõem-se lateralmente (em paralelo) e fazem pontes de H entre os átomos da ligação peptídica. As cadeias laterais R dos aminoácidos voltamse para cima ou para baixo do plano da folha Vista lateral Folha paralela Folha anti-paralela -C N -N C Pontes de H -C -C N N -hélice As cadeias laterais dos resíduos de aa se projetam para fora da -hélice. Resíduos achados preferencialmente em -hélice. Bom formadores de hélices alanina ácido glutâmico leucina metionina Maus formadores de hélices glicina prolina serina tirosina Folha b     as folhas b combinam regiões distantes da proteína possuem, em geral, de 5 a 10 resíduos as pontes de Hidrogênio se formam entre o grupo carboxílico de uma cadeia e o amino de outra. podem ser paralelas ou antiparalelas. Bom formadores de fita b: valina, isoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofano e treonina. Maus formadores de fita b: prolina, cisteína, ácido glutâmico, ácido aspártico, glutamina e lisina. ANTIPARALELA PARALELA antiparalela Paralela, torção à direita Paralela, torção à esquerda Folhas b paralelas e antiparalelas podem se formar em uma proteína através de pequenas torções da cadeia polipeptídica. A -hélice e a folha b são os tipos de estrutura secundária mais comum entre as proteínas, por que não dependem da composição e sequência de aminoácidos, sendo estabilizadas apenas por pontes de H dos átomos da ligação peptídica. Entre os 20 aminoácidos, apenas a prolina não pode fazer nenhuma das duas estruturas, por formar uma ligação peptídica mais rígida em torno do C. Existem outros tipos de estruturas secundárias conhecidas, como a dobra b ou “alças” (domínios) de ligação a íons, como Ca2+ ou Zn2+. tipo 1 tipo 2 Dobra b “Zinc-finger” hélice-dobra-hélice Voltas ou Loops • conectam as - hélices e as folhas b • em geral, estão na superfícies das proteínas • loops que conectam fitas b adjacentes são ditos hairpin loops •em geral, são flexíveis • sítios de clivagem para proteases alteram a direção da cadeia polipeptídica Bom formadores de voltas: glicina, serina, aspártico, prolina, asparagina Distribuição dos aminoácidos nas diferentes estruturas secundárias. Estrutura terciária Refere-se a todos os aspectos do dobramento tridimensional de um polipeptídeo. Ocorrem diversas interações entre as cadeias laterais dos resíduos dos aminoácidos da proteína. Forças que garantem a estrutura terciária.  A estrutura 3D de uma proteína é determinada por sua sequência de aminoácidos.  A função de uma proteína depende de sua estrutura e cada proteína tem uma estrutura única.  As proteínas na sua conformação funcional e enovelada estão em seu estado nativo. ligação de hidrogênio interações de van der Waals e hidrofóbicas ligação dissulfeto “esqueleto” polipeptídico ligação iônica O que determina a estrutura terciária são as cadeias laterais dos aminoácidos Algumas cadeias são tão longas e hidrofóbicas que perturbam a estrutura secundária helicoidal, provocando a dobra ou looping da proteína. Muitas vezes, as partes hidrofóbicas da proteína agrupam-se no interior da proteína dobrada Longe da água e dos íons do ambiente onde a proteína se encontra, deixando as partes hidrofílicas expostas na superfície da estrutura da proteína. Regiões como "sítio ativos", "sítios regulatórios" e módulos são propriedades da estrutura terciária Beta-alfa-beta Barril beta Só beta Só alfa Barril alfa-beta A estrutura terciária descreve a forma tridimensional final de uma cadeia polipeptídica, resultando da associação de partes organizadas da molécula, chamadas de “domínios” ou “motivos” protéicos. Alguns modelos de organização estrutural, como os barris b e b, aparecem em vários tipos de proteínas, às vezes não relacionadas. Estrutura Quaternária Refere-se ao dobramento final de uma proteína. Ela acontece em proteínas que apresentam mais de uma cadeia polipeptídica. Estas são chamadas de subunidades. Estrutura de Proteínas Subunidade (uma cadeia polipeptídica) Proteína (biológicamente ativa; dímero não covalente ) Proteínas com estrutura quartenária são composta de mais de uma cadeia polipeptídica, que podem estar associadas covalentemente (pontes dissulfeto) ou não. Por que uma proteínas tem várias subunidades? a) Cooperatividade: A hemoglobina (tetrâmero) liga-se ao O2 cooperativamente. b) Função Catalítica: Enzimas (dímeros) com subunidades que catalisam reações diferentes, mas que são etapas de um longo processo metabólico. c) Síntese: Uma chaperonina tem 14 subunidades; ou seja, é muito grande para ser sintetizada sozinha. Algumas definições importantes: - Por serem conceitos didáticos, frequentemente é difícil distinguir em uma proteína os níveis secundário e terciário de organização estrutural. - Para evitar tais ambiguidades utiliza-se o termo conformação proteica, que se refere aos aspectos da estrutura tridimensional de uma proteína acima de sua sequência de aminoácidos. - Os termos conformação e configuração não são sinônimos.  Configuração refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula determinada por ligações covalentes, como por exemplo, as formas Le D- de um aminoácido.  Conformação refere-se à estrutura tridimensional de uma molécula decorrente da somatória de ligações fracas, não covalentes. Conformação nativa de uma proteína refere-se à estrutura tridimensional em que a molécula apresenta suas propriedades biológicas naturais. Desnaturação refere-se a alterações da conformação nativa de uma proteína, podendo resultar em perda parcial ou total, reversível ou irreversível, de sua atividade biológica. Classificações das Proteínas Quanto à constituição: Holoproteína = apoproteína + grupo prostético Grupos prostéticos: moléculas não-peptídicas ligadas covalentemente à proteína. Classificações das Proteínas Quanto à forma: Proteínas Fibrosas Proteínas Globulosas PROTEÍNAS FIBROSAS Na sua maioria são insolúveis nos solventes aquosos e possuem pesos moleculares elevados. São filamentosas com a cadeia distendida ao longo de um eixo. Possuem função estrutural e de sustentação (colágeno do tecido conjuntivo, queratinas dos cabelos, fibrina do soro sanguíneo, miosina do músculo, fibroína da seda). COLÁGENO TRIPLA-HÉLICE -hélices em solução são muito instáveis. Para se manterem como tal, é necessário que duas hélices se enrolem uma sobre a outra: coil-coil Ex: GCN4, tropomiosina, colágeno SUPER HÉLICE DO COLÁGENO QUERATINA DUAS -HÉLICES ENTRELAÇADAS PROTEÍNAS GLOBULARES De estrutura espacial mais complexa, são mais ou menos esféricas. Possuem tanto α-hélices como folhas β. As fibrosas possuem apenas 1 tipo de estrutura secundária. São geralmente solúveis nos solventes aquosos e os seus pesos moleculares situam-se entre 10000 e vários milhões. Entre elas existem as enzimas, proteínas de transporte, hormônios (insulina) e anticorpos (imunoglobulinas). PROTEÍNAS GLOBULARES HEMOGLOBINA Tetrâmero – 4 cadeias polipeptídicas. Duas cadeias α e duas cadeias β. Grupo heme PROTEÍNAS: ANEMIA FALCIFORME Doença genética Hemácias não conseguem ligar o O2 Troca de um resíduo de aminoácido na sequência primária ácido glutâmico (Glu) pela valina (Val) PROTEÍNAS: ANEMIA FALCIFORME Células defeituosas que obstruem vasos  dor Vivem mais ou menos 30 dias  pouca vida útil anemia hemolítica Transplante de medula Peso Molecular das Proteínas A massa de uma proteína é expressa em Daltons (Da). - - - Dalton: unidade de massa bastante próxima da massa do hidrogênio (1,008). John Dalton: (1766-1844) desenvolveu a Teoria Atômica da matéria. Kilodalton: 1KDa = unidade de massa igual a 1000 Da. Enovelamento Protéico Como uma proteína adota sua conformação nativa e funcional? Como ela se mantém enovelada? “Protein folding problem” “A sequência primária de uma proteína determina sua estrutura tridimensional” O Paradoxo de Levinthal, 1968: Uma proteína não pode experimentar todas as possíveis conformações entre o estado desenovelado e o estado nativo. Imagine uma proteína com 150 aa que experimentam apenas as 3 conformações previstas no plote de Ramachandran. Cada conformação se interconverteria na outra em picoseg (10-12s). Essa proteína, então, possuiria 3150 possíveis conformações (= 1068). Para experimentar todas essas conformações seriam necessários 1068 x 10-12 seg = 1056 seg = 1048 anos !!! O enovelamento demora de 0.1 a 1000 seg in vivo e in vitro. O enovelamento é, portanto, dirigido passando por rotas cinéticas e intermediários bem definidos escapando de conformações irrelevantes. Experimento de Christian Anfinsen década de 50 Ribonuclease: proteína composta por 124 aminoácidos com 4 pontes de S Por que diferentes moléculas de uma proteína apresentam sempre a mesma estrutura 3D ? De onde vem a informação para a estrutura tridimensional de uma proteína ? O pesquisador sueco Christian Anfinsen foi um pioneiro no estudo da estrutura 3D de proteínas, e recebeu o Prêmio Nobel (1972) por suas descobertas. Anfinsen estudou a Ribonuclease (14.000d), proteína com 8 cisteínas formando 4 pontes dissulfeto. Ele demonstrou que era possível fazer uma desnaturação reversível da proteína, adicionando uréia e 2-mercaptoetanol para abrir as suas 4 pontes dissulfeto. Ao retirar lentamente (por diálise), esses reagentes, a proteína volta a ter atividade biológica, mostrando que voltou à sua conformação nativa. Esse fato é surpreendente pois as 8 cisteínas, combinadas 2 a 2, dariam 28 = 256 possibilidades, de formar diferentes pontes dissulfeto, mas apenas o arranjo original de pontes se forma. A conclusão de Anfinsen foi a de que a sequência dos aminoácidos (não alterada na desnaturação) é o que determina a estrutura 3D das proteínas. “As proteínas são marginalmente estáveis” (10-20 kcal/mol) Isso é importante pois garante turnover das proteínas e flexibilidade A maioria das interações que mantém a estrutura nativa são fracas. • pontes de hidrogênio • interações iônicas - entre resíduos carregados • interações hidrofóbicas - entre resíduos apolares • pontes de enxofre Agentes desnaturantes: • caotrópicos : uréia, cloreto de guanidina , perclorato de sódio, etc • solventes • pH • Calor •Detergentes Desnaturação e Renaturação de Proteínas Do que depende a desnaturação e renaturação? Desnaturação e Renaturação de Proteínas Calor A clara do ovo, que contém albumina, coagula formando um sólido branco. Não adianta tentar redissolver (renaturação) abaixando a temperatura. Ocorre a destruição das pontes de hidrogênio e interações hidrofóbicas, desenovelando a molécula. Desnaturação e Renaturação de Proteínas pH A variação do pH interfere nas cargas das cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos. Em pH ácido durante a formação do ácido láctico, a caseína do leite pode precipitar. Desnaturação e Renaturação de Proteínas Detergentes O dodecilsulfato de sódio (SDS) desnatura as proteínas introduzindo cargas negativas ao longo da proteína desnaturada. A porção hidrofóbica do detergente interage com as cadeias laterais hidrofóbicas da proteína, enquanto a parte polar da molécula estabelece forte interação com o solvente e os grupos polares da proteína. Estas duas forças tendem a abrir e desordenar a estrutura da proteína. Desnaturação e Renaturação de Proteínas Substâncias Caotrópicas O b-mercaptoetanol e a uréia causam desnaturação por competir pelas pontes de hidrogênio entre os grupos funcionais da proteína. Em altas concentrações, pode haver uma desestabilização das pontes de hidrogênio intracadeia com consequente mudança na conformação nativa da proteína. Desnaturação e Renaturação de Proteínas Solventes Orgânicos Cristal da Proteina Ras: (A) na presença de 50% TFE, (B) 60% hexanodiol, (C) meio aquoso. Structure, 2003. Vol.11(7), p 747-751. Sua ação vai depender do grau de polaridade do solvente, e portanto da sua capacidade de interagir com certos grupos laterais da proteína. O efeito desnaturante desses solventes pode diminuir se utilizados em baixas temperaturas, o que favorece a insolubilidade da proteína. Comportamento das proteínas na presença de soluções salinas. Ao adicionarmos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento da força iônica do sistema. Assim, ao adicionarmos pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas. Conseqüentemente, temos um aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso. A esse fenômeno dá-se o nome de "salting-in". Esse efeito, porém, não se estende indefinidamente. Em condições de elevada força iônica, decorrente da adição de grandes quantidades de sal, temos uma maior interação proteína-proteína, diminuindo a solubilidade em meio aquoso e, conseqüentemente, precipitação da proteína, Temos portanto o fenômeno de "salting-out“. A precipitação de proteínas pela alta concentração de sais é um processo muito importante para a separação de misturas complexas de proteínas, uma vez que a concentração de sal necessária para precipitação é diferente para cada proteína. Problemas que dificultam a passagem I  N: • agregação devido a superfícies hidrofóbicas expostas • formação de pontes de S incorretas • isomerização dos resíduos de prolina  Proteínas Chaperones Proteína-dissulfeto-isomerase Proteína-peptidil-prolil-cis-trans-isomerase Colapso Hidrofóbico: escondendo os resíduos apolares • a formação da estrutura secundária não é a força que dirige o enovelamento já que os resíduos na proteína desenovelada fazem pontes de H com a água e no estado nativo fazem pontes de H entre si. • Os resíduos apolares precisam, no entanto, se esconder da água. Isso limita o número de possíveis conformações acessíveis. Início do enovelamento! • Os resíduos polares deixam de fazer pontes de H com a água e fazem entre si. Surgem os elementos de estrutura secundária! Os três mecanismos clássicos de enovelamento: A. Fersht and V. Daggett, 2002, Cell Enovelamento Assistido : Chaperones • Nas bactérias existem as Dsb (disulfide-bridge forming enzimes) que ficam no periplasma • Em eucariotos existem as PDI (protein-disulfide isomerases) no retículo endoplasmático que corrigem proteínas com pontes incorretas • BPTI (bovine pancreatic tripsin inhibitor): possui 6 resíduos de cisteína que formam 3 pontes de S (58 aa). 30-51 5-55 14-38 Isomerização dos resíduos de Prolina • Na forma trans, os peptídeos são mais estáveis (C=O e N-H apontando para direções opostas) • para a maioria dos petídeos, a forma cis é 1000 vezes mais instável que a forma trans • Entretanto, quando existem prolinas, a forma cis é apenas 4 vezes mais instável que a forma trans • em algumas proteínas as prolinas aparecem na forma cis • a isomerização cis-trans é muito lenta in vitro. • in vivo, a proteína peptidil prolil isomerase (procariotes e eucariotes) aumenta a isomerização de prolinas em 1.000.000 de vezes • essa proteína está envolvida na imunosupressão inibindo a proliferação das células T (chamada de ciclofilina, pois liga ciclosporina A) Chaperonina: caixa de enovelamento • Antes de enovelar, as proteínas expõem segmentos hidrofóbicos que tendem a agregar • as chaperones podem ser induzidas pelo choque térmico • chaperones são chamadas de heat shock proteins • DNA K (Hsp 70) • GroEL e GroES (Hsp 60 e 10) chamada de chaperoninas -se ligam a polipeptídeos desenovelados ou parcialmente enovelados - são promíscuos Gro EL - Paul Sigler and Arthur Horwich,1994 • 14 subunidades que formam 2 anéis com uma cavidade central • cada subunidade tem 3 domínios: equatorial, intermediário e apical • contem 7 sítios de ligação a ATP • Gro ES se liga formando um tampa