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ENZIMAS
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O que são as enzimas? As enzimas são encontradas na natureza. São catalisadores naturais na forma de proteínas. Catalisam reações bioquímicas nas células dos organismos vivos. 2
O que são as enzimas?
AS ENZIMAS SÃO SUBSTÂNCIAS QUÍMICAS BEM DEFINIDAS
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ENZIMAS
Definição: Catalisadores biológicos; Sintetizadas pelas céls; Longas cadeias de aminoácidos.
Aminoácidos: H
R
C*
COOH
NH2
C/ exceção de grupo de moléculas de RNA c/ propriedades catalíticas (RIBOZIMAS), todas as enzimas são PROTEÍNAS.
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ENZIMAS - HISTÓRICO Catálise
biológica → início séc. XIX digestão da carne: estômago; digestão do amido: saliva.
Década
de 50 → Louis Pasteur Fermentação do açúcar em álcool pela levedura catalisada por “fermentos” = enzimas. 1878
→ Wilhelm Kühne empregou pela 1ª vez termo "enzima“ (=levedar) p/ descrever o fermento
Eduard Buchner (1897) extratos de levedo fermentavam açúcar → álcool; enzimas funcionavam mesmo quando removidas 5da célula.
ENZIMAS - HISTÓRICO
James Sumner (1926) Isolou e cristalizou a urease; “todas as enzimas são proteínas”. John Northrop (década 30) Cristalizou a pepsina e tripsina bovinas; Séc → XX (década de 50) 75 enzimas → isoladas e cristalizadas; Ficou evidenciado caráter protéico. Hoje + de 2000 enzimas conhecidas. 6
ENZIMAS – CARACTERÍSTICAS GERAIS
Altamente específicas;
Produtos naturais biológicos;
Reações baratas e seguras;
Altamente eficientes e econômicas → aceleram velocidade das reações (108 a 1011 + rápidas) → ↓ energia de ativação;
Não são tóxicas. 7
ENZIMAS – NOMENCLATURA E CLASSIFICAÇÃO
Século XIX - poucas enzimas identificadas.
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ENZIMAS – NOMENCLATURA 1955 - Comissão de Enzimas da União Internacional de Bioquímica (IUB) → nomear e classificar. Cada enzima → código c/ 4 dígitos que caracteriza o tipo de reação catalisada: 1° dígito - classe 2° dígito - subclasse 3° dígito - sub-subclasse 4° dígito - indica o substrato 9
ENZIMAS – NOMENCLATURA - Geral → Sufixo ”ASE” ao nome do substrato: * gorduras (=lipo) – LIPASE * amido (=amylon) – AMILASE * proteína – PROTEASE * Lactose – LACTASE * Hidrólise do ATP – ATPase * Ligação peptídica – PEPTIDASE * Ligação glicosídica - GLICOSIDASE - Nomes arbitrários: * Tripsina e pepsina – proteases 10
CLASSES DE ENZIMAS N0 Classe Tipo de reação catalisada 1 Oxirredutases Transferência de elétrons (íons hidreto ou átomos H) 2 Transferases Reações de transferência de grupos 3 Hidrolases Reações de hidrólise 4 Liases Adição de grupos em ligas duplas ou remoção de grupos com a formação de ligas duplas 5 Isomerases Transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros 6 Ligases Formação de ligações C-C, C-S, C-O, C-N pelo acoplamento da clivagem do ATP 11
ENZIMAS – CLASSIFICAÇÃO Subclasses
Exemplos de Tipo de reação catalisada Subclasses Hidratases Adicionam H2O à ligas duplas Quinases Transferem fosforilas do ATP Mutases Movem fosforilas dentro da mesma molécula Sintases Síntese independente de ATP Sintetases Síntese dependente de ATP
Classe Liases Transferase Isomerase Transferases Ligases 12
Enzimas - Classificação 1. Oxirredutases – transferência de elétrons Lactato desidrogenase AH2 + B
A + BH2
Exemplo Ácido Lático Desidrogenase COOH CO CH3
NADH
Ácido Pirúvico
NADox
COOH H-C- OH CH3 Ácido Lático
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Enzimas - Classificação 1. Oxirredutases – transferência de elétrons
Etanol
Acetaldeído
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Enzimas Classificação 2. Transferases transferência de grupos
Exemplo: Hexoquinase
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Enzimas - Classificação 2. Transferases -
transferência de grupos
Exemplo: Aminotransferase
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Enzimas - Classificação 3. Hidrolases - reações de hidrólise Exemplo: Lactase
Lactose
H2O
Glicose + Galactose
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Enzimas - Classificação 4. Liases – adição ou remoção de grupos (H2O, NH4+, CO2).
Ex: Fumarase
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Enzimas - Classificação 5. Isomerase – transferência de grupos dentro da mesma molécula, formação de isômeros
Triose Phosphate Isomerase
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Enzimas - Classificação 6. Ligases – reações de síntese com consumo de ATP
Exemplo: Piruvato carboxilase
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ENZIMAS – NOMENCLATURA ATP + D-Glicose
ADP + D-Glicose-6-fosfato
IUB - ATP:glicose fosfotransferase
E.C. 2.7.1.1 2 - classe - Transferase 7 - subclasse - Fosfotransferase 1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que usa grupo hidroxila como receptor 1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato
Nome trivial: Hexoquinase
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ENZIMAS - FUNÇÃO Catalisam
reações que ocorrem nas vias metabólicas.
Atuam
na degradação das moléculas dos nutrientes. Energia química liberada é conservada na forma de ATP.
Atuam
na síntese de macromoléculas a partir de precursores simples. 22
ENZIMAS - IMPORTÂNCIA Algumas
doenças (ex. desordens genéticas) ⇒ pode ocorrer nos tecidos deficiência de 1 ou + enzimas.
Medida
da atividade de certas enzimas nos tecidos é importante no diagnóstico de certas doenças. 23
LOCALIZAÇÃO: Algumas enzimas são armazenadas nos lisossomos ou vacúolos, no citoplasma ou nas mitocôndrias
Por quê? •Isolar enzima do substrato ou produto; •Ambiente adequado à catálise; •Organização. 24
ESTRUTURA:
Poucas formadas por 1 mol. protéica → ENZIMAS MONOMÉRICAS → peso molecular baixo. ENZIMAS OLIGOMÉRICAS → + de 2 cadeias polipeptídicas → iguais ou não. Muitas vezes → associada a uma estrutura não AA → maioria. 25
MECANISMO DE AÇÃO ENZIMÁTICA
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ENZIMAS – CATALISADORES Aceleram reações químicas Catalase
H2O2
H2 O +
O2
Ex: Decomposição do H2O2 Condições da Reação
Energia livre de Ativação KJ/mol Kcal/mol
Sem catalisador
75,2
18,0
Enzima Catalase
23,0
5,5
Velocidade Relativa
1 6,51 x 108 27
ENZIMAS – CATALISADORES Não são consumidas na reação
Catalase
H2O2
E+S
H2O + O2
E+P 28
ENZIMAS – CATALISADORES Atuam em pequenas concentrações
1 molécula de Catalase
decompõe 5 000 000 de moléculas de H2O2 pH = 6,8 em 1 min
Número de renovação = n° de moléculas de substrato convertidas em produto/1 única mol. de enzima/unidade de tempo. 29
ENZIMAS – CATALISADORES Não alteram o estado de equilíbrio
Energia
• Diminuem a energia de ativação.
Diferença entre a energia livre de S e P
Energia de ativação s/ enzima
S
Energia de ativação c/ enzima
P Caminho da Reação
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ENZIMAS – COMPONENTES DA REAÇÃO
E+S
ES
Substrato se liga ao SÍTIO ATIVO da enzima
P+E
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ESTRUTURA DA QUIMIOTRIPSINA – sítio ativo + substrato (verde) 32
ENZIMAS – SÍTIO ATIVO Região da molécula enzimática que participa da reação c/ substrato. Pode ter componentes não protéicos: cofatores, grupos prostéticos (lig. forte), coenzimas (lig. fraca).
Porção protéica Cofator APOENZIMA
Grupo Prostético(+)/coenzima(-)
holoenzima
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COFATORES ENZIMÁTICOS Algumas
p/ ter atividade catalítica precisam de grupos químicos adicionais → cofatores.
Cofatores
podem ser:
íons
inorgânicos → fazem a aproximação. moléculas orgânicas complexas 34
ENZIMAS – COFATOR Algumas enzimas que necessitam de elementos inorgânicos como cofatores ENZIMA
COFATOR
PEROXIDASE
Fe+2 ou Fe+3
CITOCROMO OXIDASE
Cu+2
ÁLCOOL DESIDROGENASE
Zn+2
HEXOQUINASE
Mg+2
UREASE
Ni+2 35
ENZIMAS – COENZIMAS Cofator org necessário à ativ. de algumas enzimas. Maioria deriva de vitaminas hidrossolúveis Classificam-se em: - transportadoras de hidrogênio - transportadoras de grupos químicos
Transportadoras de hidrogênio Coenzima Abreviatura Reação Origem catalisada Nicotinamida adenina NAD+ Oxi-redução Niacina ou dinucleotídio Nicotinamida adenina NADP+ dinucleotídio fosfato Flavina adenina FAD dinucleotídio
Vitamina B3 Oxi-redução Niacina ou Vitamina B3 Oxi-redução Riboflavina ou Vitamina B2 36
ENZIMAS – COENZIMAS Transportadoras de grupos químicos
Coenzima Coenzima A
Abrev. Reação catalisada Origem Pantotenato ou CoA-SH Transferência de
Biotina Piridoxal fosfato
PyF
Metilcobalamina Tetrahidrofolato
THF
Tiamina pirofosfato
TPP
grupo acil Transferência de CO2 Transferência de grupo amino Transferência de unidades de carbono Transferência de unidades de carbono Transferência de grupo aldeído
Vitamina B5 Biotina ou Vitamina H Piridoxina ou Vitamina B6 Cobalamina ou Vitamina B12 Ácido fólico Tiamina ou Vitamina B1
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ENZIMAS – LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO Michaelis & Menten: grande especificidade das enzimas → Modelo da Chave-Fechadura → enzima possui sítio ativo complementar ao substrato.
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ENZIMAS – LIGAÇÃO ENZIMA - SUBSTRATO Koshland (1958): Encaixe Induzido → enzima e substrato sofrem conformação p/ o encaixe → substrato assume conformação exata.
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CENTRO ATIVO → parte da estrutura da enzima q se liga ao substrato
Região que não faz parte do centro ativo, mas que, ao se modificar, altera forma do centro ativo → CENTRO ALOSTÉRICO. Compostos que atuam sobre o centro alostérico → melhoram atuação do centro ativo → EFETORES ALOSTÉRICOS POSITIVOS. Os que fazem o contrário → NEGATIVOS. Centro alostérico não existe em todas as enzimas → enzimas alostéricas ou nãoalostéricas. 40
Alostéricas → controlam a transformação de um S e, qdo ele precisa ser gasto, elas atuam bem. Várias subunidades, mudança conformacional em 1 induz alterações em outra.
não-alostéricas → funcionam sempre c/ mma eficiência, dependendo da [S] ou da [P] → obedecem leis do equilíbrio dinâmico → + S → + eficientete é transformado em P, quanto + P → - enzima gasta o S p/ gerar o mesmo P. 41
ATIVIDADE ENZIMÁTICA:
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ENZIMAS – ATIVIDADE ENZIMÁTICA Enzima pura, condições que permita a velocidade da reação seja máxima → ↑ [S] de modo a permitir que toda a enzima [E] ⇒ [ES]. Fatores que alteram a velocidade de reações enzimáticas: - Efeito de sais e solventes; - pH; - temperatura; - concentração da enzima; - concentração do substrato; - presença de inibidores.
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ENZIMAS – INFLUÊNCIA DOS SAIS E SOLVENTES
[sais] pode influenciar na conformação final da enzima. Meio aquoso → água, sais e enzimas interagem → interação → forma final da enzima → pronta p/ atuar sobre substrato. Alteração da [sais] → equilíbrio entre os constituintes alterado → altera conformação da enzima. 44
ENZIMAS – INFLUÊNCIA DO pH Varia estado de ionização dos componentes do sistema a medida que muda o pH. Enzimas → grupos ionizáveis, existem em ≠ estados de ionização.
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ENZIMAS – INFLUÊNCIA DO pH ENZIMA
pH ÓTIMO
Pepsina
1,5
Tripsina
7,7
Catalasa
7,6
Arginasa
9,7
Fumarasa
7,8 46
ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA ↑ temperatura: (a) ↑ a taxa de reação → como na maioria das reações químicas; (b) a estabilidade da proteína decresce devido a desativação térmica.
Enzima → Tº ótima p/
atividade máxima → Tº máxima na qual enzima possui atividade cte por um período de tempo.
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ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA TEMPERATURA O efeito da temperatura depende: - pH e - força iônica do meio; Acima da Tº ótima → o ↑ velocidade de reação devido a temperatura é compensado pela perda de atividade catalítica devido à desnaturação térmica. ENZIMA
TEMPERATURA ÓTIMA (°C)
Pepsina
31,6
Tripsina
25,5
Urease
20,8
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ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA [E] Velocidade de transformação do S em P proporcional qdade de E. Desvios da linearidade ocorrem: - Presença de inibidores na solução de enzima; - Presença de substâncias tóxicas; - Presença de um ativador que dissocia a enzima; Recomenda-se: Enzimas c/ alto grau de pureza; Substratos puros; 49
ENZIMAS – INFLUÊNCIA DA [S] [S] varia durante o curso da reação à medida que S é convertido em P. Medir Vo = velocidade inicial da reação. [E] = cte. vo [S] pequenas → Vo ↑ linearmente. [S] maiores → Vo ↑ por incrementos cada vez menores. Vmax → [S]↑ ↑ → Vo↑ ↑ insignificantes. Vmax é atingida → E estiverem na forma ES e a [E] livre é insignificante.
Vmax
50
[S]
CINÉTICA ENZIMÁTICA:
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ENZIMAS – CINÉTICA ENZIMÁTICA Victor Henri (1903): E + S ⇔ ES ⇔ P + E Cinética Enzimática Determinar constantes de afinidade da enzima pelo S e pelos inibidores; Conhecer condições ótimas da catálise; Ajuda a elucidar os mecanismos de reação; Determinar a função de uma enzima em uma rota metabólica.
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ENZIMAS – INIBIÇÃO ENZIMÁTICA Qualquer substância que reduza a velocidade de uma reação enzimática.
INIBIDORES
REVERSÍVEIS
IRREVERSÍVEIS XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX
COMPETITIVOS
NÃO COMPETITIVOS 53
ENZIMAS – INIBIÇÃO IRREVERSÍVEL
Inibidores reagem quimicamente c/ enzima Inativação praticamente irreversível. Organofosforados: ligação covalente c/ OH dos resíduos da serina; Penicilina: ligação específica c/ enzimas responsáveis pela síntese da parede bacteriana. 54
INIBIÇÃO REVERSÍVEL COMPETITIVA: substrato e inibidor competem p/ mesmo sítio
→ zero
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INIBIÇÃO NÃO-COMPETITIVA: substrato e inibidor competem p/ sítios ≠s; inibidor somente liga ao complexo ES
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ENZIMAS – APLICAÇÕES Enzimas utilizadas em rações p/ aves Enzima
Substrato
Efeitos
Xilanase
Arabinoxilanas
Redução da viscosidade da digesta.
Glucanases
β-glucanos
Redução da viscosidade da digesta. Menor umidade na cama.
Pectinases
Pectinas
Redução da viscosidade da digesta.
Celulases
Celulose
Degradação da celulose e liberação de nutrientes
Proteases
Proteínas
Suplementação das enzimas endógenas. Degradação mais eficiente de proteínas.
Amilases
Amido
Degradação mais eficiente do amido.
Fitase
Ácido fítico
Melhora a utilização do fósforo dos vegetais. Remoção do ácido fítico.
Galactosidases
Galactosídios
Remoção de Galactosídios
Lipases
Lipídios e ácidos graxos
Melhora a utilização de gorduras animais e vegetais 57
ENZIMAS – APLICAÇÕES Tratamento de efluentes Preocupação ambiental → procura
por outras
alternativas → chamadas "tecnologias limpas“. Enzimas → substituem muitos componentes químicos
utilizados
nos
processos
industriais
atuais. 58
ENZIMAS – APLICAÇÕES Enzimas utilizadas em tratamento de efluentes Enzima e fonte
Poluentes e efluentes
Azorredutase (Pseudomonas luteola)
Indústria de tinta
Catalase (Baccilus sp.)
Remoção de H2O2 presente em efluentes de branqueamento de tecidos
Polifosfatase e Fosfotransferase
Remoção de fosfato biológico de efluentes
Protease pronase (Pseudomonas aeruginosa)
Inativação de vírus de efluentes, para reutilização da água
Naftaleno-dioxigenase
Remoção de naftaleno
Lipase (Penicillium P4)
Remoção do teor de DQO de efluentes de óleo de oliva
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ENZIMAS – APLICAÇÕES Indústria de álcool; Indústria de detergentes; Indústria têxtil; Indústria de papel e celulose; Curtumes; Produção de ácido cítrico, ácido glutâmico, insulina, vacinas, vitaminas e antibióticos; Biorremediação.
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Benefícios do uso de enzimas derivadas de OGMs na produção de alimentos Maior qualidade nos produtos enzimáticos: - maior pureza. - novas enzimas que de outra forma não seriam encontradas comercialmente, produzidas e usadas em grande escala. Benefícios ambientais: - enzimas produzidas de fontes renováveis. - completamente degradáveis. - propiciam economia de energia, água ... 61
Enzimas feitas sob medida p/ um processo específico: melhoram processo de produção e qualidade do produto. Melhor uso das matérias primas ex.: indústria de sucos Menos desperdício de alimentos ex.: panificação Uso reduzido de produtos químicos tradicionais ex.: indústria de processamento de amidos
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