Transcript
PROF.: Aline Aires
DISCIPLINA: Imunologia Clínica
ELISA
Palmas
2008
Gilson Tavares: _______________________________
Jakeline Vasconcelos: __________________________
Milena Késia Nunes:____________________________
Larissa Magri:_________________________________
Larysse:______________________________________
Samira Sousa:_________________________________
Sheila Teixeira:________________________________
ELISA
Palmas
2008
INTRODUÇÃO
Sabe-se que a rubéola é uma doença infecciosa ocasionada por um vírus do gênero Rubivirus, é mais comum em crianças, mas pode ocorrer também em adultos.
O modo de transmissão é através do contato com as secreções nasofaríngeas de pessoas infectadas. A infecção é produzida por disseminação de gotículas ou através de contato direto com pessoas contaminadas.
Métodos rápidos e simples, são empregados na prática diária, no diagnóstico de rubéola congênita, diagnóstico da infecção pós natal e para determinar o estado imunitário. O ensaio imunoenzimático (ELISA) e a inibição da hemaglutinação (IHA) são os principais m étodos utilizados atualmente.
A IHA, baseia-se na capacidade do vírus de aglutinar hemácias e na propriedade de inibição desta pelo anticorpo específico. É uma reação trabalhosa, com inúmeras variáveis (hemácias , antígenos , inibidores específicos , temperatura e pH) e de custo e levado. O método ELISA é mais sensível, específico e rápido. Por isso, a tendência atual é substituir a IHA pelo ELISA.
ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) é um método de detecção imunológico que determina um antígeno quantitativamente e qualitativamente. Anticorpos atrelados a enzimas se unem a antígenos ou anticorpos os quais são detectados por uma reação colorida catalisada, ou seja, trata-se basicamente de um teste imunoenzimático.
É um processo muito comum o qual tira vantagens da habilidade do sistema imunológico para produzir anticorpos capazes de se acoplar e com isso rotular moléculas-alvo específicas.
Possui diversas aplicações, nas mais variadas áreas e, dentre os vários testes imunoenzimáticos, o tipo não competitivo – conhecido como sanduíche – é bastante utilizado como método de triagem na indústria de alimentos.
MATERIAIS E METODOS
REAGENTES
Amostra: Soro
Kit para detecção de Rubéola:
Diluente da amostra
Solução de lavagem (Tampão)
Água destilada
Conjugado
Diluente conjugado
Solução padrão
Substrato
Solução 'STOP'
MATERIAIS
Tubos de Ensaio;
Micropipetas;
Placa de poliestireno;
Becker;
Estante para placa.
MÉTODOS
Diluir a amostra em Diluente da amostra de 1/101(10µL da Amostra + 1mL de Diluente)
Preparar a Solução de lavagem (20x) de 1/20 em água destilada (100µL + 1900µL de água destilada) em duplicata, ou seja, pra cada lavagem;
Diluir o Conjugado(20x) de 1/20 em Diluente conjugado(10µL de conjugado + 190µL de diluente conjugado);
Colocar nos poçinhos, 50µL de cada padrão e da amostra;
Encubar 1 hora em temperatura ambiente;
Lavar 2x com 200µL de Solução de Lavagem;
Colocar 50µL do Conjugado diluído em cada poçinho;
Encubar por 1 hora em temperatura ambiente;
Lavar, novamente, 2x com 200µL de Solução de Lavagem;
Colocar 50µL do Substrato;
Encubar por 20' a temperatura ambiente;
Colocar 50µL de Solução "STOP";
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RESULTADOS E DISCURSÃO
Para a análise feita os resultados foram insatisfatórios por motivo desconhecido, mas possivelmente por erro de procedimento, pois não houve a formação de cor para o controle positivo. A intensidade da cor desenvolvida pelo substrato é proporcional a quantidade de anticorpos (específicos para o antígeno) presente no soro. A intensidade pode ser analisada por um espectrofotômetro, permitindo uma análise quantitativa. No caso a leitura foi visual o que não é recomendado de forma alguma.
CONCLUSÕES
O teste de ELISA é relativamente simples, mas demora cerca de 2h e 20min. Para o teste realizado não houve reação alguma, pois o reagente sabidamente positivo para rubéola não formou cor alguma.
ANEXOS
Placa para realização do teste de ELISA
REFERENCIAS
Mandel, G. L.. Principles and Practive of Infeccions Diseases, 3th ed, Chuchill Livingstone Inc., 1990, 1242-1248.
Tonelli, E., Melo L.. Doenças Infecciosas na Infância, 529-542.
Chernesky M., and Mahony J.. Manual of Clinical Microbiology, 5th, American Society for Microbiology, 1992, 918-923.
