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25/3/2011
Universidade Federal de Sergipe Departamento de Morfologia/CCBS Laboratório de Parasitologia
Parasitologia Clínica
Parasitologia Clínica
O que são ENTEROPARASITOSES? As enteroparasitoses ou parasitoses intestinais são doenças cujos agentes etiológicos são helmintos ou protozoários, os quais, em pelo menos uma das fases do ciclo evolutivo, localizam-se no aparelho digestivo do homem, podendo provocar diversas alterações patológicas. As parasitoses intestinais são endemia importante nos países em desenvolvimento, particularmente naqueles situados na faixa equatorial, onde as condições climáticas se aliam ao baixo nível sócio-econômico, saneamento básico deficiente, má educação sanitária e outros fatores relacionados com a pobreza.
Prof. Dr. Silvio Dolabella
Parasitologia Clínica
EPIDEMIOLOGIA As parasitoses ... O exame parasitológico de fezes ainda é a ferramenta fundamental no diagnóstico das parasitoses que tem na via anal a via de eliminação das formas evolutivas (Coura, 2005).
O diagnóstico baseado em parâmetros morfológicos ainda é o mais realizado por ser realizado por técnicas mais acessíveis e mais econômicas.
• Ainda são consideradas um grave problema de Saúde Pública. • Doença mais comum do globo terrestre.
• Comprometem 25% da população mundial.
OMS, 2007
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EPIDEMIOLOGIA - BRASIL
EPIDEMIOLOGIA- MUNDO
Ascaridíase Tricuríase
Bilhões de pessoas
1,4 1,2
ascaridíase tricuríase
1
ancilostomíase
0,8
amebíase
0,6
enterobíase giardíase
0,4
estrongiloidíase
0,2
teníase
0
Parasitoses
OMS, 2007
Manifestações Clínicas X Agentes • Suboclusão/ Infestação – Ascaris lumbricoides
Giardíase Amebíase Ancilostomíase Estrongiloidíase
16% - 41% 11% - 40% 6% - 44% 4% - 23% 2% - 17% 1% - 9%
Enterobíase
2% - 4%
Teníase
0,04% - 1,2% Plano Nacional de Vigilância e Controle das Enteroparasitoses, Ministério da Saúde, 2005
Manifestações Clínicas X Agentes • Pneumonia – Síndrome de Loeffler – Necator, Ascaris, Strongyloides, Ancylostoma.
Prurido anal Enterobius vermicularis
Prolapso retal Trichuris trichiura
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Localizações mais freqüentes dos parasitas
Manifestações Clínicas X Agentes
• Síndromes disabsortivas – Giardia lamblia
• Diarréia paciente HIV + – Cryptosporidium, Isospora, Microsporidium
• Disseminaçao no Imunossuprimido – Strongyloides
HELMINTOS • Nematelmintos (vermes cilíndricos)
• Platelmintos (vermes achatados)
– Ascaris lumbricoides
– Taenia solium
– Enterobius vermicularis
– Taenia saginata
– Trichuris trichiura
– Hymenolepis nana
– Necator americanus
– Hymenolepis diminuta
– Ancylostoma duodenale
– Diphylobothrium latum
– Strongyloides stercoralis
ESTÁGIOS DOS HELMINTOS – Ovos embrionados
– Ovo com larva madura
– Larva
– Adulto
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HELMINTOS INTESTINAIS MAIS COMUMENTE ENCONTRADO EM AMOSTRAS FECAIS
PRINCIPAIS HELMINTOS INTESTINAIS DO HOMEM
HELMINTOS INTESTINAIS MAIS COMUMENTE ENCONTRADO EM AMOSTRAS FECAIS
PROTOZOÁRIOS • • • • •
Entamoeba histolytica Giardia intestinalis (= Giardia lamblia) Cryptosporidium parvum Isospora belli Microsporídeos e Balantidium coli – Comensais: Endolimax nana, Entamoeba coli, Iodamoeba butschlii, Dientamoeba fragilis.
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ESTÁGIOS DOS PROTOZOÁRIOS
PROTOZOÁRIOS INTESTINAIS MAIS COMUMENTE ENCONTRADO EM AMOSTRAS FECAIS
– Trofozoítos
– Cistos
– Oocistos
• Importância – Tratamento/Medidas de controle – Levantamento epidemiológico – Diagnóstico parasitologico – Pesquisa
• Novos medicamentos • Novos métodos diagnósticos
Amostra • Acondicionamento e remessa – Toda a amostra deve ser acondicionada em frasco hermeticamente fechado e enviado ao laboratório em até 02 horas
• Importância da qualidade da amostra – Fidedignidade (confirmar suspeita) – Reavaliação (confirmar eficácia terapêutica)
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Coleta
Coleta Controle de qualidade para coleta do material • Detecção e a identificação dos parasitos/qualidade da amostra • Na coleta dos espécimes fecais, vários fatores devem ser considerados: Tipo do recipiente Volume Idade da amostra Drogas e compostos químicos • Recipiente sempre limpo e seco, livre de anti-sépticos, de agentes germicidas, gotas de óleo e de urina. • As fezes excretadas no solo não devem ser utilizadas.
Controle de qualidade para coleta do material
• Fezes obtidas de privadas não podem ser aproveitadas. • Não coletar fezes após o uso de contraste radiológico (sulfato de bário). • O uso de antibióticos, antidiarréicos, antiácidos, derivados de bismuto, vaselina e os óleos minerais interferem no resultado. • Os espécimes fecais nunca devem ser incubadas a 37 C ou congelados antes do exame. • Recipientes com amostras fecais, recebidos de pacientes imunocomprometidos deverão ser protegidos por invólucro de plástico e identificados com etiqueta vermelha.
Coleta
Coleta
Controle de qualidade para coleta do material
Preservação das amostras A Refrigeração (3-5ºC):
• Cada amostra deverá apresentar:
preservação de ovos e cistos por vários dias
larvas de Strongyloides stercoralis e de ancilostomídeos podem sofrer alterações morfológicas.
Nome do paciente Número de identificação Nome do médico
Data e hora da coleta; requisição médica (procedimento laboratorial)
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Fezes
Considerações Gerais
. Exame macroscópico Permite a verificação da consistência das fezes, odor, presença de elementos anormais(muco e sangue) e de vermes adultos ou partes deles.
• O exame macroscópico microscópico.
. Exame microscópico Permite a visualização dos ovos ou larvas de helmintos, cistos, trofozoítos ou oocistos de protozoários.
• O material fecal varia conforme a consistência: Fezes formadas Semiformadas Pastosas Líquidas (diarréicas)
* Métodos quantitativos * Métodos qualitativos
deve
sempre
preceder
ao
exame
• Adultos de Ascaris lumbricoides, Enterobius vermicularis e proglotes de Taenia sp podem ser encontrados no bolo fecal.
Fezes * Métodos quantitativos São aqueles onde se realiza a contagem dos ovos nas fezes, permitindo assim avaliar a intensidade do parasitismo. Pouco utilizados. * Métodos qualitativos Permitem demonstrar a presença das formas parasitárias sem, entretanto, quantificá-las.
Fezes • EPF – Denominação da maioria das técnicas de observação microscópica das fezes, sendo o exame direto e a concentração do material, oocistosfecal, os mais utilizados. Servem para a identificação de ovos de helmintos, cistos e trofozoítosde protozoários. • Exame direto - Material fecal é analisado sem o uso de técnicas de concentração - Eficaz apenas nas infecções maciças - deve ser utilizado juntamente com outras técnicas • Diluição em salina (microscopia direta em campo claro)
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Leitura das lâminas:
Fezes • Técnicas de concentração – Testes de densidade
• Sedimentação espontânea (HPJ ou Método de Lutz) • Sedimentação por centrifugação (Blagg, Ritchie) • Flutuação – Sulfato de Zinco (Faust) – Sacarose (Sheather) – Cloreto de Sódio (Willis)
– Testes específicos
Objetivas menores para objetivas maiores
I. Técnicas de concentração • Sedimentação espontânea (HPJ ou Método de Lutz) √ Princípio : Método qualitativo que fundamenta-se na sedimentação espontânea das formas parasitárias. √ Aplicações clínicas : Método de escolha para a pesquisa de ovos pesados, sendo muito útil também para a pesquisa de outros ovos e larvas de helmintos e cistos de protozoários.
• Pesquisa de ovos de Enterobius vermicularis (Método da fita adesiva ou Método de Graham) • Pesquisa de larvas (Baermann-Moraes e Rugai) • Pesquisa de ovos de Schistisoma mansoni (Kato)
I. Técnicas de concentração • Sedimentação espontânea (HPJ ou Método de Lutz) √ Procedimento : - Colocar aproximadamente 2grs. de fezes em um copo plástico descartável (ou frasco Borrel ou outro cálice de fundo chato), acrescentar cerca de 5mL de água e, com um “palito de picolé” (ou bastão de vidro), desfazer o bolo fecal.
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I. Técnicas de concentração • Sedimentação espontânea (HPJ ou Método de Lutz) √ Procedimento : - Acrescentar mais 20mL de água e homogeneizar.
I. Técnicas de concentração
I. Técnicas de concentração • Sedimentação espontânea (HPJ ou Método de Lutz) √ Procedimento : - Filtrar a suspensão para um cálice cônico com capacidade para 200mL, através de gaze cirúrgica dobrada em quatro. Lavar os detritos retidos na gaze com mais 20mL de água, recolhendo o líquido da lavagem no mesmo cálice.
I. Técnicas de concentração
• Sedimentação espontânea (HPJ ou Método de Lutz)
• Sedimentação espontânea (HPJ ou Método de Lutz)
√ Procedimento : - Completar o volume do calice com água.
√ Procedimento : - Completar o volume do calice com água.
- Deixar essa suspensão em repouso durante 2 a 24 horas.
- Deixar essa suspensão em repouso durante 2 a 24 horas.
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I. Técnicas de concentração
I. Técnicas de concentração
• Sedimentação espontânea (HPJ ou Método de Lutz)
• Sedimentação espontânea (HPJ ou Método de Lutz)
√ Procedimento : - Técnica para se colher o sedimento para exame:
√ Procedimento : - Técnica para se colher o sedimento para exame:
1. introduzir uma pipeta até o sedimento contido no fundo do cálice, retirar o dedo e deixar subir uma pequena porção do sedimento. Recolocar o dedo e retirar a pipeta.
2. colocar parte do sedimento em uma lâmina, cobrir com lamínula (facultativo) e examinar com as objetivas de 10x e/ou 40x. Deve-se examinar, no mínimo, duas lâminas de cada amostra. Todas as lâminas poderão ser coradas pelo lugol ou este ficar restrito àquelas onde houver cistos de protozoários e/ou larvas de helmintos.
I. Técnicas de concentração
I. Técnicas de concentração
• Sedimentação por centrifugação (Método de Ritchie) √ Princípio : Método qualitativo que fundamenta-se na sedimentação por centrifugação das formas parasitárias. √ Aplicações clínicas : Pesquisa de ovos e larvas de helmintos, cistos e oocistos de protozoários.
• Sedimentação por centrifugação (Método de Ritchie) √ Procedimento : - Diluir 10grs. de fezes em ~20mL de água filtrada e homogeneizar bem.
- Filtrar a mistura em gaze cirúrgica dobrada em quatro, num copo plástico descartável ou outro recipiente limpo.
OBS: O Método de Blagg e colaboradores (MIFC) é semelhante ao método de Ritchie partindo de amostra de fezes preservada em conservante MIF.
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I. Técnicas de concentração • Sedimentação por centrifugação (Método de Ritchie) √ Procedimento : - Transferir 1 a 2mL do filtrado para um tubo cônico de centrifugação, com capacidade para 15mL.
I. Técnicas de concentração • Sedimentação por centrifugação (Método de Ritchie) √ Procedimento : - Centrifugar por um minuto a 1.500 rpm.
- Acrescentar 4 a 5mL de éter sulfúrico e agitar vigorosamente. éter detritos
água
sedimento
I. Técnicas de concentração
I. Técnicas de concentração
• Sedimentação por centrifugação (Método de Ritchie)
• Sedimentação por centrifugação (Método de Ritchie)
√ Procedimento : - Descolar a camada de detritos da parede do tubo.
√ Procedimento : - Acrescentar ao sedimento gotas de salina e/ou lugol.
- Inverter o tubo para desprezar o líquido, mantendo-o com a boca voltada para baixo, até limpar as paredes do mesmo, utilizando um bastão de vidro contendo algodão na extremidade.
- Inverter o tubo em uma lâmina, deixando escoar todo o sedimento. Se a quantidade de sedimento for excessiva, utilizar uma pipeta para colhê-lo e preparar as lâminas.
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I. Técnicas de concentração • Sedimentação por centrifugação (Método de Ritchie) √ Procedimento : - Cobrir com lamínula e examinar com as objetivas de 10x e/ou 40x, fazendo a pesquisa dos parasitos intestinais. Observação : as lâminas poderão ser coradas pelo lugol ou este ficar restrito àquelas onde houver cistos de protozoários e/ou larvas de helmintos.
I. Técnicas de concentração • Centrífugo-flutuação em Sulfato de Zinco (Método de Faust) √ Procedimento : - Diluir 10grs. De fezes em 20mL de água filtrada. - Homogeneizar bem.
I. Técnicas de concentração • Centrífugo-flutuação em Sulfato de Zinco (Método de Faust) √ Princípio : Método qualitativo que fundamenta-se na centrifugação das fezes no sulfato de zinco (ZnSO4), onde as formas parasitárias mais leves ficarão na película superficial e os detritos mais pesados no sedimento. √ Aplicações clínicas : Pesquisa de cistos de protozoários e ovos leves de helmintos, como por exemplo, ovos de ancilostomídeos.
I. Técnicas de concentração • Centrífugo-flutuação em Sulfato de Zinco (Método de Faust) √ Procedimento : - Desprezar a água sobrenadante e ressuspender o sedimento com uma solução de sulfato de zinco a 33%, densidade de 1,18 g/mL.
- Filtrar através de gaze dobrada em quatro, num copo plástico, e transferir para um tubo de Wasserman. - Centrifugar por um minuto a 2.500 rpm. água.
- Desprezar o líquido sobrenadante e ressuspender o sedimento em
- Repetir o procedimento de lavado mais duas ou três vezes, até que o líquido sobrenadante fique claro.
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I. Técnicas de concentração
I. Técnicas de concentração
• Centrífugo-flutuação em Sulfato de Zinco (Método de Faust) √ Procedimento : - Centrifugar novamente por um minuto a 2.500 rpm. - Os cistos (e ovos leves) presentes estarão na película superficial, que é coletada com alça de platina, colocada em uma lâmina junto com uma gota de lugol e coberta com lamínula.
• Flutuação no Açúcar (Método de Sheather) √ Princípio : Método qualitativo que fundamenta-se na flutuação de oocistos em solução de açúcar. Exame qualitativo direto. Método de eleição para Eimeria spp. e Isospora spp. √ Aplicações clínicas : Pesquisa, principalmente, de oocistos de protozoários.
Observação: o material deve ser examinado imediatamente, pois o contato com a solução de sulfato de zinco pode deformar os cistos de protozoários, dificultando a identificação.
I. Técnicas de concentração • Flutuação no Açúcar (Método de Sheather) √ Procedimentos: - Misturar, em partes iguais, fezes e solução fisiológica. - Filtrar a suspensão em gaze dobrada em quatro partes. - Recolher o filtrado em tubo de centrífuga, completando até a metade. - Completar o tubo com solução saturada de açúcar. - Cobrir o tubo com papel celofane transparente ou um pedaço de lamínula de plástico e fixá-lo com uma gominha. - Homogeneizar bem por agitação. - Centrifugar por cinco minutos a 1.500 rpm ou deixar em repouso durante uma hora. - Retirar a lamínula, colocar sobre uma lâmina e observar com objetiva de 40x.
I. Técnicas de concentração • Flutuação solução saturada de NaCl (Método de Willis) √ Princípio : Método qualitativo que se baseia na flutuação do material fecal em solução saturada de cloreto de sódio. √ Aplicações clínicas : Pesquisa de estruturas de baixa densidade como ovos de ancilostomídeos e cistos de protozoários.
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I. Técnicas de concentração • Flutuação solução saturada de NaCl (Método de Willis) √ Procedimentos: - Colocar 10 grs. de fezes em um frasco de Borrel (pode ser usado o próprio frasco no qual as fezes foram enviadas).
I. Técnicas de concentração • Flutuação solução saturada de NaCl (Método de Willis) √ Procedimentos: - Colocar na boca do frasco um lâmina, que deverá estar em contato com o líquido. - Deixar em repouso por cinco minutos.
I. Técnicas de concentração • Flutuação solução saturada de NaCl (Método de Willis) √ Procedimentos: - Diluir as fezes em solução saturada de NaCl. - Completar o volume até a borda do frasco.
I. Técnicas de concentração • Flutuação solução saturada de NaCl (Método de Willis) √ Procedimentos: - Retirar rapidamente a lêmina, coltando para cima a parte molhada. - Cobrir com lamínula, levar ao microscópio e examinar com a objetiva de 10x e/ou 40x (pode-se ou não corar pelo lugol).
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II. Testes Específicos
II. Testes Específicos
• Pesquisa de ovos de Enterobius vermicularis (Método da fita adesiva ou Método de Graham)
• Pesquisa de ovos de Enterobius vermicularis (Método da fita adesiva ou Método de Graham)
√ Princípio e Aplicações clínicas: Método baseado na biologia do Enterobius vermicularis. As fêmeas migram para a região anal e perianal, onde se rompem por algum traumatismo ou dessecamento; os ovos permanecem aderidos à mucosa nessa região. Assim, são facilmente coletados com fita adesiva. Eventualmente pode ser utilizado para coletar ovos de Taenia.
√ Procedimentos: - Preparar 4cm de fita adesiva trasparente, colando uma tira de papel de 5cm nas extremidades, para a identificação do paciente. - Colocar a fita adesiva com a parte colante para fora sobre um tubo de ensaio, firmando a fita pela tiras de papel. - Apôr o tubo com a fita na região perianal, preferencialmente pela manhâ. - Aderir a fita adesiva sobre uma lâmina de microscopia, comprimindo bem e levar ao microscópio para exame.
II. Testes Específicos
II. Testes Específicos
• Pesquisa de larvas (Método de Baermann-Moraes) √ Princípio : Método qualitativo que fundamenta-se na concentração de larvas de helmintos por migração ativa, devido ao hidrotropismo e termotropismo positivos.
√ Aplicação Clínica : Pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.
• Pesquisa de larvas (Método de Baermann-Moraes) √ Procedimento : - Colocar 8 a 10 grs. de fezes numa gaze dobrada em quatro ou peneira.
- Colocar o material assim preparado sobre um funil de vidro, contendo um tubo de borracha conectado à extremidade inferior de sua haste.
Obs: Recomenda-se a utilização de fezes recémcolhidas, sem conservantes.
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II. Testes Específicos
II. Testes Específicos
• Pesquisa de larvas (Método de Baermann-Moraes) √ Procedimento : - Obliterar o tubo de borracha com uma pinça de Hoffman e adicionar, ao funil, água aquecida a 45ºC, em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes. - Deixar uma hora em repouso.
• Pesquisa de larvas (Método de Baermann-Moraes) √ Procedimento : - Após esse tempo, abrir a pinça e colher 5 a 7 mL da água, em um tubo de centrífuga. - Centrifugar a 1000 rpm por um minuto. - Colher o sedimento, sem desprezar o líquido sobrenadante e examinar ao microscópio (10x). Caso se detecte a presença de larvas, essas deverão ser coradas com lugol e observadas com a objetiva de 40x, para identificação. As características de S.stercoralis são vestíbuo bucal curto e primórdio genital visível.
II. Testes Específicos
II. Testes Específicos
• Pesquisa de larvas (Método de Rugai)
• Pesquisa de larvas (Método de Rugai)
√ Princípio : Método qualitativo que fundamenta-se na concentração de larvas de helmintos por migração ativa, devido ao hidrotropismo e termotropismo positivos.
√ Aplicação Clínica : Pesquisa de larvas de Strongyloides stercoralis.
√ Procedimento : - Retirar a tampa do recipiente que acondiciona as fezes e envolvê-lo em uma gaze dobrada em quatro, fazendo uma pequena “trouxa”. - Colocar o material assim preparado, com a abertura voltada para baixo, em um cálice de sedimentação, contendo água aquecida a 45oC, em quantidade suficiente para entrar em contato com as fezes. - Deixar uma hora em repouso.
Obs: Recomenda-se a utilização de fezes recémcolhidas, sem conservantes.
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II. Testes Específicos • Pesquisa de larvas (Método de Rugai) √ Procedimento : - Coletar o sedimento do fundo co cálice com a ajuda de uma pipeta. - Examinar ao microscópio, com a objetiva de 10x. - Corar as larvas com o lugol e observá-las com o maior aumento, para identificação.
II. Testes Específicos • Pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni (Método de Kato) √ Princípio : O método se fundamenta na concentração dos ovos, por um processo de tamisação na tela de Kato. A glicerina, contida na solução de Kato, irá clarificar os ovos, que irão sobressair devido ao verde malaquita, também presente na solução. √ Aplicação Clínica : Pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e Ancylostomatidae. Para este último as lâminas deverão ser examinadas no máximo até uma hora depois de sua preparação, pois após esse período os ovos ficam irreconhecíveis.
II. Testes Específicos • Pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni (Método de Kato) √ Procedimentos : - Cortar o papel celofane semipermeável em pedaços de 24mm por 32mm e deixá-lo mergulhado na solução de verde-malaquita por pelo menos 24 horas. - Colocar, sobre um papel higiênico, uma amostra de fezes a ser examinada. - Comprimir as fezes com um pedaço de tela metálica ou de náilon, cujos orifícios tenham 200µm de cada lado.
II. Testes Específicos • Pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni (Método de Kato) √ Procedimentos : - Cobrir as fezes com a lamínula de papel celofane, inverter a lâmina sobre uma folha de papel absorvente liso e comprimi-la..
- Aguardar uma a duas horas e examinar ao microscópio, verificando a presença de ovos na preparação. - Examinar duas lâminas de cada paciente.
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II. Testes Específicos • Pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni (Método de Kato-Katz) √ Princípio : Modificação da técnica de Kato por Katz e colaboradores, utilizada para a quantificação do número de ovos nas fezes. √ Aplicação Clínica : Pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichiura e Ancylostomatidae. Para este último as lâminas deverão ser examinadas no máximo até uma hora depois de sua preparação, pois após esse período os ovos ficam irreconhecíveis.
III. Outras Técnicas para Identificação de Enteroparasitos • Tamisação das fezes √ Método para pesquisa de proglotes de Taenia, por meio de lavagem e peneiragem das fezes coletadas durante 24 horas. Este processo oferece vantagem por permitir o diagnóstico diferencial entre T. solium e T. saginata após clarificação e observação das proglotes. É indicado também para o controle de cura das teníases.
II. Testes Específicos • Pesquisa de ovos de Schistosoma mansoni (Método de Kato-Katz) √ Procedimentos : No método quantitativo, as fezes, depois de passadas pela tela, devem ser transferidas, com o auxílio de um palito, para o orifício (66mm de diâmetro) de um cartão retangular de plástico, colocado sobre uma lâmina de microscopia. Após encher completamente o orifício, retirar o cartão, cuidadosamente, deixando as fezes (aproximadamente 42mg) sobre a lâmina de vidro. Cobrir as fezes com a lamínula de papel celofane e comprimí-la como já descrito anteriormente. Ao exame microscópico, todos os ovos deverão ser contatos. O número de ovos encontrados na preparação, multiplicado por 23, corresponderá ao número de ovos por grama de fezes.
III. Outras Técnicas para Identificação de Enteroparasitos • Hematoxilina férrica √ Método de coloração para protozoários intestinais, permite estudo morfológico detalhado. É uma técnica complicada por apresentar várias etapas para sua execução.
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III. Outras Técnicas para Identificação de Enteroparasitos • Método de Henriksen & Pohlenz (Kinyon ou Ziehl-Neelsen modificado)
“O valor clínico do exame
√ Método de coloração utilizado para o diagnóstico de parasitas protozoários intestinais oportunistas, como Cryptosporidium e Isospora. Cora estruturas álcool-ácido resistentes com fucsina contrastadas com verdemalaquita.
microbiológico não pode ser maior do que a confiança que merece o laboratório que o executou.” (Kolmer JA, Clinical Diagnosis by Laboratory Examinations,. 1ª edição, 1945)
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