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Faculdade Metropolitana de Campinas
VERIS
Curso de Nutrição
Bromatologia
Determinação de proteínas pelo método de Kjeldahl
Campinas
2011
Determinação de proteínas pelo método de Kjeldahl
Relatório apresentado à
disciplina de bromatologia,
ministrado pela, como forma de
avaliação prática do conteúdo.
Campinas
2011
Sumário
Introdução 1
Objetivos 2
Materiais 3
Métodos 4
Resultados 5
Discussão 7
Conclusão 9
Referências bibliográficas: 10
Introdução
Proteínas são macronutrientes constituídos por uma cadeia de aminoácidos
unidos por ligações peptídicas. Possuem funções estruturais, de
transporte, hormonal, de armazenamento e defesa. Diferenciam-se
quimicamente das outras frações de nutrientes que constituem um alimento
por possuírem um átomo de nitrogênio em sua composição.
A partir desta particularidade, pode-se determinar a quantidade de
proteínas presentes nos alimentos. O método mais utilizado é pelo processo
de digestão Kjeldahl, proposto em 1883 pelo mentor de mesmo nome. Este
processo é constituído de três etapas, digestão, destilação e titulação. A
proteína sofre uma hidrolise ácida e, assim a matéria orgânica é
decomposta e o nitrogênio transformado em amônia. Sendo o conteúdo de
nitrogênio das diferentes proteínas aproximadamente 16%, introduz-se o
fator empírico 6,25 para transformar o numero de g de nitrogênio
encontrado em número de g de proteínas.
Objetivos
Objetivo geral:
Conhecer as etapas do método de digestão de Kjeldahl, para determinar a
concentração de proteínas na amostra.
Objetivo especifico:
Analisar as etapas de digestão, destilação e titulação da amostra,
analisando detalhadamente cada uma a fim de compreender os processos a que
a amostra foi submetida e como estes interferem na determinação da
concentração proteica.
Materiais e métodos
Materiais:
- 1 béquer de 50 ml
- 2 Erlenmeyer de 250 ml
- 4 Tubos micro Kjedahl
- Leite em pó
- 1 Balança Analítica
- 1 Bloco Digestor
- 1 Destilador de Proteína
- 1l Solução de NaOH 40 %
- 1l Solução de H3BO3 a 2 % p/v
- 100 ml Vermelho de metila, 0,1 % em álcool
- 100 ml Verde de bromo cresol, 0,1 % em álcool
- Solução padronizada de HCL 0,02N
- Bureta de 50 ml com suporte
- 100 g mistura catalisadora: 96% de k2SO4, 4 % CuSO4.5H2O bem moídos
e misturados
- 500 ml Ácido sulfúrico concentrado, com baixo teor de nitrogênio
Métodos
Foram pesados 200 g de leite em pó, 1,5 g de mistura catalisadora e 3 ml
de ácido sulfúrico concentrado. Em seguida a amostra foi transferida para
o tubo micro-kjedahl, e colocada no bloco digestor por cerca de 1 a 6
horas e, resfriada. Assim, este processo foi realizado antes da aula, pela
técnica de laboratório.
Após resfriada a amostra sofreu o processo de destilação, foram
adicionados 3 ml de água ao tubo micro-kjedahl e, 10 ml de hidróxido de
sódio ao copo destilador. No aparelho destilador a amostra foi destilada
pela presença de hidróxido de sódio que volatiliza a amônia, esta foi
recolhida em um Erlenmeyer de 250 ml contendo, 10 ml de solução de ácido
bórico, com os indicadores vermelho de metila, 4 gotas, e verde de
bromocresol, 6 gotas. O ácido bórico fixou a amônia, formando o borato de
amônia. A destilação persistiu por alguns minutos, até que a solução
contida no Erlenmeyer obtivesse uma coloração azul, foram recolhidos 100
ml, com o cuidado de não desligar o aparelho destilador, para não haver
refluxo para o tubo com ácido concentrado.
O destilado foi titulado com ácido clorídrico (HCl) 0,0 2 N. Uma bureta de
50 ml foi completada com HCl , e gotejada na amostra ate que esta passasse
da cor verde azulado para roxo claro.
Resultados
O método de Kjeldahl consiste na digestão da amostra protéica por ácido
sulfúrico, destilação com fixação da amônia pelo ácido bórico e, titulação
com ácido clorídrico onde, o volume deste utilizado na titulação vai
determinar a quantidade de nitrogênio da amostra e, conseqüentemente a
quantidade de proteína, visto que, em geral o nitrogênio corresponde a 16%
do peso da amostra protéica.
No experimento realizado em primeira aula pratica, obteve-se 4,3 ml de
ácido clorídrico (HCl) na titulação, com este volume a solução de borato
de amônia tornou-se roxa claro, o que indica que o ácido desprendeu a
amônia da molécula de borato.
Levando-se em consideração que a massa atômica do HCl é aproximadamente
36, com massa atômica 1 do hidrogênio e 35 do cloro e, que segundo Cecchi
(2003), o método é uma titulometria de neutralização onde 1 mol de HCl é
igual a 1 mol de nitrogênio (N), obteve-se os seguintes resultados:
1 mol HCl__________ 36 g
X mol _____________ 0.043 g
Logo, em 0,043 g de HCl, tem-se 0,0119 mols, que é igual a 0,0119
mols de N.
A massa atômica do nitrogênio é de aproximadamente 16. Fazendo a
conversão:
Massa de N= Volume de HCl . Massa de HCl . mol de N (CECCHI, 2003).
Massa de N = 0.043. 0.0119 . 14
Massa de N = 0.716
Proteína total = Nitrogênio total. Fator
Proteína total = 0.716. 6.25
Proteína total= 4.475 %
Em uma segunda amostra, titulou-se mais de 150 ml de HCl sem que a amostra
passasse da cor azul para roxo claro, isto pode ter ocorrido devido a
superaquecimento do aparelho de destilação. A alta temperatura pode ter
volatizado a amônia e, assim houve grande perda de nitrogênio.
Discussão
A qualidade nutricional de uma proteína pode ser medida através do
conhecimento da sua concentração nos alimentos e da sua composição de
aminoácidos. Para a determinação dos aminoácidos em um alimento, são
utilizadas técnicas cromatográficas. O método mais utilizado para a
determinação da concentração de protéica é o de Kjeldahl, que parte do
conceito de que a fração de nitrogênio não-protéico de um alimento é
irrelevante e, na determinação de nitrogênio total obtém-se o conteúdo de
proteínas. (COULTATE, 2004).
A proporção de nitrogênio para a maioria das proteínas é de 16% do peso
total, ou seja, em 100 g de proteínas, 16 g corresponde a nitrogênio.
Assim, um fator de 6.25, que é a diferença entre o peso total e o peso
correspondente ao nitrogênio, é utilizado para converter o teor deste em
concentração de proteínas. Em alguns alimentos, como cereais, que têm
variações na concentração de aminoácidos, um fator diferenciado é utilizado
para obter-se maior precisão. (COULTATE, 2004; ZENEBON et al, 2008).
No método referido, primeiramente a amostra protéica passa por uma
hidrolise ácida, com ácido sulfúrico concentrado, na presença de calor e de
uma mistura catalisadora que acelera a reação. Sendo a proteína formada por
cadeias de aminoácidos unidos por ligações peptídicas que, segundo Mahan
(2005), "é formada entre o grupo carboxila do primeiro aminoácido e o
nitrogênio do segundo'', o ácido hidrolisa os grupamentos amina.
A mistura catalisadora, utilizada na hidrólise ácida, é composta de
substancias que aumentam a velocidade da reação, fornecendo um mecanismo de
reação diferente entre reagentes e produtos. Os catalisadores mais
utilizados são mercúrio, cobre e selênio, geralmente é utilizada uma
mistura, pois, em pequenas concentrações evita-se os problemas de toxidez e
perda de nitrogênio causada por estes. (ANDRADE, 2009; CECCHI, 2003).
Após permanecer no bloco digestor por algum tempo, a amostra torna-se
transparente, o que indica que esta totalmente digerida e, transformada em
sulfato de amônia. Esta amostra passa pelo processo de destilação, no tubo
micro-kjeldahl é adicionado água e hidróxido de sódio (NaOH) 40% para
alcalinizar a amostra , esta é destilada pelo aparelho. A amônia
desprendida é recolhida em um erlenmyer com ácido bórico, que fixa a amônia
formando o borato de amônia de coloração azul. (CECCHI, 2003).
Para perceber-se o ponto de equivalência entre o titulante e a amostra são
utilizados indicadores, como o verde de bromocresol e vermelho de metila,
estes sofrem a mudança de cor indicando que o ponto de equivalência foi
atingido.
A titulação é feita com ácido clorídrico. Na aula pratica utilizou-se HCl
0,02 N, segundo Rosenberg (2002), a normalidade exprime o número de
equivalentes-gramas de soluto existente em um litro de solução.Assim, 20 g
de soluto estavam presentes em 1 litro da solução ácida utilizada.
O borato de amônia obtido na destilação, é titulado com este ácido , que
desloca a amônia da molécula de borato. O ponto de equivalência é atingido
quando a amostra adquire a cor roxa claro. (CECCHI, 2003.)
Na aula pratica, com 4,3 ml de HCl atingiu-se o ponto de equivalência. Em
uma segunda amostra utilizou-se mais de 150 ml de ácido sem que a amostra
passasse de azul para roxo. Isto pode ter ocorrido devido a
superaquecimento do aparelho de destilação, causando a volatilização da
amônia, perdendo assim o nitrogênio da amostra.
Conclusão
O método de Kjeldahl para determinação de proteínas, é uma técnica
relativamente simples e econômica para analise de alimentos. Entretanto, as
etapas de digestão, destilação e titulação têm que ser realizadas
cuidadosamente, pois a concentração dos reagentes interfere no resultado
final, além disso, o aparelho digestor deve estar calibrado para que não
haja superaquecimento e, conseqüente perda de nitrogênio por volatilização
da amostra.
A determinação da concentração de proteínas nos alimentos esta relacionada
com a qualidade protéica dos mesmos, e o nitrogênio pode ser utilizado como
parâmetro, pois a sua presença na composição das proteínas é uma
particularidade da mesma.
Referências bibliográficas:
ANDRADE, Edira Castello Branco; Análise de alimentos uma visão química da
nutrição, 2ª edição, Varela, São Paulo, 2009, pg 62-65.
CECCHI, Heloisa Mascia; Fundamentos teóricos e práticos da análise de
alimentos, 2ª edição, UNICAMP, Campinas, 2003, pg 61-64
COULTATE, T.P.; Alimentos a química de seus componentes , 3ª edição,
Artmed, Porto Alegre, 2004, pg 113-116
MAHAN, L. Kathleen; Krause, Alimentos, Nutrição e Dietoterapia, 11[ edição,
Roca, São Paulo, 2005.
ROZENBERG, Izrael Mordka; Química geral, 2ª edição , Edgard Blucher Ltda.,
São Paulo, 2002 , pg 452-453
ZENEBON, Odair, PASCUET; Neus Sadocco; TIGELA, Paulo; Métodos físico-
químicos para analise de alimentos, 4 edição, Instituto Adolfo Lutz, São
Paulo, 2008, pg 122-124.
