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Cromatografia em papel
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Cromatografia Um dos problemas que continuamente desafiam os bioquímicos é a separação e a purificação de um ou mais compostos de uma mistura complexa. Um dos mais convenientes métodos para realizar tal separação é o uso de técnicas cromatográficas. Tais técnicas pode ser usadas para a separação de grandes quantidades (diversas gramas) ou pequenas quantidades (picogramas) de material. Uma grande variedade de técnicas modernas, tanto analíticas quanto preparativas, são denominadas de cromatografia. O que elas possuem em comum é a propriedade de fracionar uma mistura complexa de substâncias usando a diferença de características química entre os componentes da misturas, o que faz com que eles interajam diferencialmente com uma fase estacionária e com uma fase móvel. Existem quatro tipos principais de cromatografia: cromatografia líquida, cromatografia gasosa, cromatografia de camada fina e cromatografia em papel. A seleção de uma forma particular de cromatografia para produzir uma determinada etapa de separação é dependente do material a ser isolado e, freqüentemente, diversos métodos cromatográficos podem ser usados seqüencialmente para que seja obtido um composto na forma pura. Um leito cromatográfico pode ser construído de vários formas, mas ele sempre consistirá, basicamente, de duas fases: a fase estacionária e a fase móvel. A fase estacionária (que pode ser sólida ou líquida ou pode consistir de uma mistura de um sólido com um líquido) é finamente dividida e fixada a um suporte. A fase móvel (que pode ser líquida ou gasosa) preenche os interstícios da fase estacionária e deve ser capaz de fluir através desta fase. As fases móvel e estacionária devem ser escolhidas de forma que os compostos que serão separados durante o processo cromatográfico possuam um coeficiente de partição definido entre as duas fases. Neste processo, vários mecanismos de distribuição podem ser empregados: a distribuição pode ser uma simples partição entre dois líquidos imiscíveis; pode ser um equilíbrio de adsorção entre uma fase estacionária adsorvente e uma fase líquida móvel; ou um equilíbrio de troca iônica entre uma fase estacionária trocadora de íon e uma fase móvel constituída por uma solução de um eletrólito. O termo coeficiente de partição ou coeficiente de distribuição é normalmente usado para descrever a forma pela qual um composto se distribui entre duas fases imiscíveis. Para a distribuição de um composto entre dois solventes, o valor para este coeficiente é uma constante a uma dada temperatura e pode ser definido como:
O coeficiente de distribuição, como ordinariamente usado, se refere a distribuição de um soluto entre duas fases líquidas. Em cromatografia, é conveniente usar o termo para descrever a distribuição de um soluto entre duas fases quaisquer. Por exemplo, o coeficiente de distribuição de uma substância entre álcool e alumina pode ser 0,1, significando que a concentração da substância em álcool (em peso por volume - p/v) é 1/10 de sua concentração em alumina (em p/v). Assim, a o coeficiente de distribuição do álcool etílico entre o ar (em p/v) e a água (também em p/v) a 30°C é de 3,05.10-4, por que 1 litro de ar conterá 3,05.10-4 vezes tanto álcool etílico do que um litro de água com a qual está em equilíbrio. O coeficiente de distribuição (K) será sempre expresso, para propósitos cromatográficos, como a concentração na fase móvel dividido pela concentração na fase estacionária.
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Outro termo que também é muito usado em cromatografia é o coeficiente de distribuição efetivo (B). Este coeficiente pode ser definido como a quantidade total de substância presente em uma fase, dividido pela quantidade total da mesma substância presente na outra fase. Por exemplo, suponha que o coeficiente de distribuição entre benzeno e água para uma substância seja de 1,0. Se esta substância for equilibrada entre 10,0 ml de benzeno e 1,0 ml de água, a concentração da substância no benzeno será a mesma que na água, mas a quantidade total do soluto no benzeno será 10 vezes maior que a quantidade na fase aquosa, assim B = 10, mas K = 1,0. Portanto, o coeficiente de distribuição efetivo é o produto do coeficiente de distribuição K multiplicado pela razão entre os volumes das duas fases presentes no sistema.
Mecanismo de separação cromatográfica Imagine uma coluna cromatográfica composta por um tubo de vidro preenchido com uma fase estacionária finamente granulada rodeada por uma fase móvel líquida (o solvente). A coluna possui 7 cm de comprimento e contém 1 ml de fase móvel por cm. Tal coluna está representada na figura abaixo. Ao topo da coluna será adicionado 1ml do solvente no qual estão dissolvidos 64µg da amostra. Ao fazer isto, 1ml do solvente fluirá para fora da coluna através de sua abertura inferior, deixando ainda um total de 7ml de solvente na coluna. Se B = 1, então, a amostra se distribuirá igualmente entre a fase móvel e a fase estacionária. Ao ocupar o centímetro superior da coluna 32µg da amostra permanecerá dissolvida na fase móvel e 32µg irá se ligar a fase estacionária. Ao se adcionar mais 1ml do solvente ao topo da coluna a fase móvel se descolará através do leito cromatográfico. O solvente que previamente ocupava o centímetro superior da coluna e que continha 32µg da amostra, será deslocado para o segundo centímetro da coluna O movimento de uma zona de soluto pode ser explicada da seguinte forma: As fibras de celulose do papel possui uma forte afinidade pela água presente na água presente na mistura de solvente, mas muito pouca afinidade pela fase orgânica. O papel, assim, pode ser visto como um suporte inerte contendo uma fase estacionária aquosa (polar). A medida que o solvente flui através de uma seção do papel contendo o soluto, uma partição deste composto ocorre entre entre a fase móvel orgânica (pouco polar) e a fase estacionária aquosa (polar). Desta forma, parte do soluto deixa o papel e entra na fase na fase móvel. Quando a fase móvel alcança uma seção do papel que não contém soluto, o fenômeno de partição ocorre novamente. Desta vez, o soluto é transferido da fase móvel para a fase estacionária. Com o fluxo contínuo de solvente, o efeito desta partição entre a fase móvel e a fase estacionária é a transferência do soluto do seu ponto de aplicação ao papel para um outro ponto localizado a alguma distância do local de aplicação, no sentido do fluxo de solvente. Usando este raciocínio, quanto maior a solubilidade do composto na fase móvel, maior será a distância que ele se deslocará da origem.
Cromatografia de aminoácidos em papel Na cromatografia em papel, por exemplo, a resolução de uma mistura de solutos sobre um papel de filtro pode depender de uma variedade de fenômenos, tais como adsorção à superfície do papel, troca iônica ou na partição entre solventes. Embora os efeitos de adsorção e de troca iônica possam estar presentes em maior ou menor extensão em todos os procedimentos cromatográficos realizados com papel de filtro, o fator predominante é usualmente o de partição da mistura de soluto a ser fracionada entre duas fases imiscíveis. Nos trabalhos iniciais realizados com a separação de misturas de aminoácidos, foi encontrado que as melhores separações eram obtidas com solventes que eram apenas parcialmente miscíveis com água. Após o equilíbrio do papel com o vapor de um solvente saturado com água, o desenvolvimento do solvente produz a separação. Os aminoácidos podem ser separados por cromatografia em papel devido a sua solubilidade que os diferentes tipos desta substância apresentam pela água de hidratação ao redor das fibras de celulose e pela fase orgânica móvel que flui através destas fibras. A solubilidade relativa dos aminoácidos nestas duas fases pode ser mudada por alterações na polaridade do solvente, ou no pH da solução, o qual irá alterar o estado iônico dos aminoácidos. Sob um conjunto adequado de
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condições, então, cada molécula de uma mistura irá se deslocar a uma diferente velocidade sobre a fase estacionária e estará a uma distância específica de um do ponto de origem, quando cessar o fluxo de solvente. Este fenômeno pode ser convenientemente expresso como um fator de retardo ou fator de retenção (Rf), definido como:
Assim, se duas amostras da mesma molécula (uma conhecida, usada como padrão, e outra desconhecida) são analisadas sob condições idênticas, ambas terão o mesmo Rf. Esta razão será também diferente (de forma ideal) do Rf de qualquer outra molécula presente na mistura, suportando, desta forma, a identificação do desconhecido. Um princípio básico dos processos cromatográficos é que uma diferença de Rf é considerada como prova de que as amostras são diferentes, entretanto valores idênticos apenas suportam a identidade dos compostos, por que duas diferentes estruturas podem ter o mesmo Rf sob um determinado conjunto de condições. Um exemplo prático, é o uso deste princípio para compreender a estrutura de uma proteína. Proteínas são polímeros de constituídos por mais de vinte diferentes tipos distintos de aminoácidos unidos por ligações peptídicas (uma ligação do tipo amida). Estes aminoácidos diferem apenas na característica química de suas cadeias laterais, que podem possuir características polar ou não polar. As cadeias com características polares podem ainda ser ácidas, básicas ou neutras. Assim, as diferentes propriedades e funções das proteínas são resultado direto de diferentes seqüências de aminoácidos. Portanto, para compreender uma proteína, nós devemos primeiro ser capazes de determinar quais aminoácidos ela contem e a ordem que estes aminoácidos estão presentes na estrutura polimérica da proteína. Para realizar esta tarefa, é necessário separar uma mistura complexa de aminoácidos e identificar cada um deles. Uma técnica antiga, mas ainda útil, que pode ser usada para isto é a cromatografia em papel. Devido ao fato dos aminoácidos não absorverem luz no comprimento de onda visível, eles não podem ser vistos. Assim, algum método deve ser usado após a cromatografia para localizá-los. A reação de ninhidrina é usada para este propósito por que reage com grupamentos amino livres produzindo um composto colorido (usualmente púrpura). Diversos aminoácidos, contudo, produzem diversas tonalidades de cores com a ninhindrina, o que pode ajudar em sua identificação. A reação da ninhindrina com prolina, por exemplo, gera um composto amarelo e a reação com a tirosina produz uma coloração azul metálica.
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