Cromatografia Em Papel

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1. INTRODUÇÃO A cromatografia foi introduzida por um pesquisador russo, Michael Tswett, em 1906, quando ele separou clorofila de uma mistura de pigmentos de planta. Ele colocou uma pequena quantidade de amostra no topo de uma coluna de vidro cheia de carbonato de cálcio em pó, e então lavou a amostra com éter de petróleo. Conforme a amostra descia pela coluna, apareciam bandas separadas e de cores distintas. Daí vem o nome da técnica, pois, em grego, "cromo" significa "cor" e "grafia" significa "escrita", o que quer dizer "escrevendo em cores". Porém a cor foi característica nesse caso, mas em outros tipos de cromatografia pode existir separação dos componentes da amostra sem nenhum aparecimento de cor. (HELOISA CECCHI, 2009). Normalmente trabalhamos em laboratório com substâncias quimicamente puras. Essa situação, no entanto, nem sempre é a verdadeira. Reagentes ou solventes podem estar impuros ou sofrer contaminação. Reações químicas, por outro lado, geralmente conduzem a misturas mais ou menos complexas de produtos que devem ser visualizados, separados e purificados ao final das mesmas. Muitos são os métodos existentes para a purificação e separação dos componentes de misturas. Entre os mais conhecidos podemos citar a catação, dissolução, cristalização, recristalização fracionada, extração, destilação e a sublimação. Estes métodos são muito úteis, são largamente empregados em laboratórios e em indústrias com bons e/ou excelentes resultados. Mas falham, no entanto, quando os diversos componentes da mistura possuem constantes físicas semelhantes, isto é, pontos de fusão ou ebulição próximos, solubilidade semelhante em um mesmo solvente (ou mistura de solventes), etc. A cromatografia permite resolver este problema. A cromatografia é um método de separação de substâncias baseado na distribuição seletiva dos diferentes componentes de uma mistura entre duas fases imiscíveis. Os métodos cromatográficos permitem separar os componentes de uma mistura pois dependem da migração seletiva e diferencial dos solutos através de um sistema constituído de duas fases: uma sólida (ou fixa) e outra fluida (ou móvel). A fase sólida é denominada adsorvente e é estacionária. Adsorção é a capacidade de uma substância (o adsorvente) em deter ou concentrar seletivamente sobre a sua superfície, gases, líquidos ou sólidos, podendo ser arrastados por uma fase móvel, denominada eluente. A cromatografia é muito utilizada para análise, separação e purificação (em pesquisa e em escala industrial) de numerosos produtos naturais: antibióticos, vitaminas, hormônios, corantes, etc. Seu uso mais conhecido, no entanto, é o da análise, localização e identificação de microgramas de substâncias em meios biológicos (exames "anti doping" e de medicina legal em geral). Cinco são os principais procedimentos cromatográficos: a cromatografia em coluna, em papel, em camada delgada, em fase gasosa e em fase líquida. (INSTITUTO DE QUÍMICA DA UFRGS, 2004). O exemplo de cromatografia mais clássico é a cromatografia em papel. Neste tipo de cromatografia, uma amostra líquida flui por uma tira de papel adsorvente vertical, onde os componentes depositam-se em locais específicos. O papel é composto por moléculas extremamente longas chamadas celulose. A celulose é um polímero, o que significa que ela é composta por milhares de moléculas menores que se organizam juntas. Esta organização molecular que compõe as cadeias de celulose é polar e, como resultado, a celulose tem muitas regiões de altas e baixas densidades de elétrons. As regiões "carregadas" em uma cadeia de celulose são atraídas para as regiões de cargas opostas de outras cadeias adjacentes, e isto ajuda a unir as fibras de papel. O fato das longas cadeias de celulose serem alinhadas em uma direção pode ser demonstrado rasgando um pedaço de jornal. Perceber-se- á que aquele jornal rasga facilmente e ao longo de uma linha bastante reta, se rasgado em uma direção, mas quando rasgado a um ângulo de 90º, o papel não rasgará facilmente ao longo de uma linha reta. (http://www.lidora.info/tijusp/cromatografia.htm). A cromatografia em papel é uma das técnicas mais simples e que requer menos instrumentos para realização, porém é a que apresenta as maiores restrições para aplicação em termos analíticos. (COLLINS, C. H., 1997). 2. CROMATOGRAFIA EM PAPEL A cromatografia em papel, desenvolvida em 1944, é uma técnica simples e econômica de separação dos componentes de uma mistura, podendo, em alguns casos, ter uma aplicação qualitativa e quantitativa. Classifica-se como cromatografia líquida - líquida, e a separação ocorre por partição do soluto entre dois líquidos. Está baseada nas diferentes solubilidades relativas dos componentes da amostra na fase móvel (líquida) e na fase estacionária (líquida). Os componentes menos solúveis na fase estacionária têm uma movimentação mais rápida ao longo do papel, enquanto os mais solúveis serão seletivamente retidos, tendo uma movimentação mais lenta. Esta técnica cromatográfica é assim chamada porque utiliza para a separação e identificação das substâncias ou componentes da mistura a migração diferencial sobre a superfície de uma tira de papel filtro de qualidade especial. (HELOISA CECCHI, 2009). Este tipo de cromatografia é de execução muito simples e necessita quantidades muito pequenas das substâncias para realizar-se a análise. A amostra é aplicada na borda inferior de uma tira de papel filtro (cromatografia ascendente) ou na borda superior (cromatografia descendente). A seguir, a tira é colocada em contato com o eluente escolhido, cuidando para que o mesmo não entre em contato direto com a amostra, deixando que ascenda ou descenda pela superfície do papel filtro. A identificação das substâncias pode ser feita por visualização direta (quando possuem cor) ou pela utilização de reveladores adequados. (INSTITUTO DE QUÍMICA DA UFRGS, 2004). Este método é muito útil para separar substâncias muito polares como os açúcares e os aminoácidos. Possui o inconveniente de poder-se cromatografar somente pequenas quantidades das substâncias por vez. Na cromatografia existem duas fases: Fase estacionária: utiliza como suporte folhas de papel filtro especiais para cromatografia que variam quanto à espessura em milímetros; Fase móvel: o eluente é um solvente puro ou uma mistura de solventes. Os principais eluentes são: "Éter de petróleo; "Tetracloreto de carbono; " "Benzeno; "Éter etílico; " "Cicloexano; "Acetato de etila; " "Clorofórmio; "Etanol; " "Diclorometano; "Ácido acético; " "Acetona; "Água destilada. " "Metanol; " " Frequentemente inicia-se os teste de separação empregando um solvente apolar, e gradualmente aumenta-se a polaridade. Pode-se usar mistura de solventes, e ir-se alterando a proporção de um solvente polar em um apolar, contanto que sejam miscíveis entre si. (http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/CROMA_P APEL.htm). 2.1. Tipos de Desenvolvimentos Ascendente A forma mais simples de cromatografia em papel é a cromatografia ascendente que utiliza uma tira de papel de comprimento e largura variáveis, em função da cuba cromatográfica a ser utilizada. Marca-se com lápis o ponto de partida da amostra, a uns 2 cm de uma das bordas do papel, e marca-se a linha de chegada da fase móvel (ou frente do solvente), geralmente distante 10-12 cm do ponto de partida. Nesse caso, deixa-se 2 cm de distância das bordas laterais e um intervalo entre os pontos de aplicação de 1,5 a 2,0 cm. O nível da fase móvel deve ficar abaixo do ponto de partida da substância, devendo, sempre, haver uma boa vedação da cuba cromatográfica para que não se perca o vapor dessa fase. Por capilaridade, a fase móvel começa a movimentar-se em fluxo ascendente, rapidamente no início, diminuindo gradativamente até parar por completo, quando a força ascendente da capilaridade for neutralizada pela ação da gravidade. Quando a fase móvel atingir a linha de chegada geralmente a 10-12 cm do ponto de partida, retira-se o papel da cuba cromatográfica e seca-se a tira de papel com secador, com ar quente ou frio, até eliminar-se a fase móvel. No caso de mistura de substâncias de componentes coloridos, à medida que ocorre a separação, a cor única se desdobrará em cores distintas em função do número de substâncias que compõem, como, por exemplo, a separação de corantes artificiais em produtos alimentícios. No caso de mistura de substâncias incolores, podem-se detectar (revelar) esses componentes por técnicas diversas. Descendente As manchas são colocadas na parte de cima do papel e este é colocado numa pequena cuba com solvente. O solvente desce por capilaridade e gravidade e, por isso, essa técnica é mais rápida, porém necessita de um equipamento mais complexo e específico. Horizontal (Circular) O solvente é colocado no centro do papel e as manchas em volta desse centro. A separação se dá de maneira circular. Não é uma técnica muito utilizada em comparação com as outras duas descritas. Bidimensional Numa primeira etapa, a fase móvel é deslocada ascendentemente e, depois, numa segunda etapa, gira-se o papel 90° e faz-se um novo deslocamento ascendente. Pode ser aplicada somente uma mancha em cada separação cromatográfica, podendo-se aplicar padrões somente na segunda eluição. (HELOISA CECCHI, 2009). 2.2. Vantagens Simples e econômica; Ultiliza pequena quantidade de amostra; Boa capacidade de resolução; Praticidade (pode recortar o papel). (HELOISA CECCHI, 2009). 3. TÉCNICAS ANALÍTICAS DA CROMATOGRAFIA EM PAPEL A amostra, que deve preferencialmente ser dissolvida em um solvente volátil, é aplicada com capilar, em um volume em µL. As quantidades de amostra variam de 1 a 100 mg, e a mancha no papel deve ter um diâmetro máximo de 0,5 cm. (HELOISA CECCHI, 2009). 3.1. Preparação Do Papel Manipula-se o papel com cuidado e pelas pontas, e cortam-se tiras em tamanhos que possam ser contidos nas cubas. É importante cortar o papel seguindo o eixo das fibras, pois a celulose está orientada neste sentido, o que facilitará a passagem da fase móvel. (http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/prepara cao_papel.htm). 2. Procedimento de uma Cromatografia em Papel As cubas deverão ser perfeitamente fechadas para permitir a saturação interna. A cromatografia pode ser ascendente ou descendente, sendo que esta última é mais rápida e consome menos eluente. Apenas 2 cm de altura de eluente na cuba é suficiente para a cromatografia ascendente. (http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/procedi mento_croma_papel.htm). Uma separação adequada dos componentes de uma mistura está relacionada com: A difusão em função da concentração: formação de cauda em concentrações muito altas, com movimentação do soluto de região de maior concentração para região de menor concentração (espalhamento); Difusão lateral: Quando soluto e fase móvel percorrem distancias diferentes (percursos laterais em determinadas regiões do papel); Equilíbrio incompleto: Não da um tempo ideal de contato do soluto entre a fase móvel e a fase estacionária por causa de fluxo rápido; Fase móvel inadequada. Uma sugestão para resolução desses problemas é a que se procure trabalhar nas condições mais próximas possíveis, de qualidade e quantidade, entre padrão e amostra, usando-se o mesmo papel, fase móvel, temperatura, etc., isto é, cromatografando-se, concomitantemente, padrão e amostra em condições absolutamente idênticas. (HELOISA CECCHI, 2009). 3. Aplicações da Cromatografia em Papel Ocorre a determinação dos seguintes componentes em vários tipos de alimentos como: "Aminoácidos, peptídeos e "Flavorizantes naturais e " "proteínas; "artificiais; " "Carboidratos; "Corantes naturais e artificiais; " "Vitaminas; "Conservantes; " "Ácidos orgânicos; "Antioxidantes; " "Alcoóis; "Estabilizantes e emulsificantes; " "Antocianinas; "Resíduos de pesticidas; " "Compostos fenólicos; "Adulterantes em geral. " " " " (HELOISA CECCHI, 2009) 4. PRIMEIRO ARTIGO CIENTÍFICO: ANÁLISE DE PIGMENTOS DE PIMENTÕES POR CROMATOGRAFIA EM PAPEL Segundo artigo citado por Núbia Moura Ribeiro e Carolina Rodeiro Nunes, os carotenóides são pigmentos naturais que trazem benefícios para a saúde por sua atividade antioxidante e anticancerígena. A cromatografia em papel é utilizada neste trabalho para separar e identificar esses pigmentos em extratos de pimentões verdes, amarelos e vermelhos. São apresentadas também informações sobre carotenóides, destacando os encontrados nos pimentões. 4.1. Resenha Os métodos cromatográficos são utilizados para separar misturas contendo duas ou mais substâncias ou íons, e baseiam-se na distribuição diferencial dessas substâncias entre duas fases: uma das quais é estacionária e a outra, móvel (Fonseca e Gonçalves, 2004). Atualmente as diferentes modalidades de cromatografia são responsáveis por mais de 70% das análises em Química Analítica (Aquino Neto e Nunes, 2003). Uma dessas modalidades é a cromatografia em papel (CP). Trata-se de uma técnica simples para análise de amostras em pequenas quantidades, aplicada principalmente na separação e identificação de compostos polares, tais como açúcares, antibióticos hidrossolúveis, aminoácidos, pigmentos e íons metálicos (Aquino Neto e Nunes, 2003). É considerada uma técnica de partição líquido-líquido. O papel consiste de celulose que pode absorver até 22% de água. É a água absorvida que funciona como fase estacionária líquida que interage com a fase móvel também líquida (Aquino Neto e Nunes, 2003). Os componentes da amostra são separados entre a fase estacionária e a fase móvel em movimento no papel. Os componentes que têm capacidade de formar ligações (ou "pontes") de hidrogênio migram mais lentamente (Collins e cols., 2006). O objetivo deste trabalho é utilizar a cromatografia em papel para separar os pigmentos de pimentões verdes, amarelos e vermelhos correspondentes às diferentes zonas cromatográficas. A coloração do pimentão se deve a capacidade de sintetizar carotenoides e de reter pigmentos de clorofilas (Collera-Zuniga e cols., 2005). Os pimentões verdes e amarelos devem sua coloração principalmente à presença de carotenos e de carotenoides oxigenados como as criptoxantinas (Bianchini e Penteado, 1998). Os pimentões vermelhos devem sua coloração pela presença de carotenoides polioxigenados, tais como as capsantinas e capsorubina (Curl, 1962). Os carotenoides são pigmentos encontrados na natureza e trazem benefícios para a saúde por sua atividade antioxidante e anticancerígena, e são classificados em carotenos (carotenoides hidrocarbonetos) e xantofilas (carotenoides oxigenados). A coloração dos carotenoides varia do amarelo, passando pelo laranja, até o vermelho intenso e resulta da multiplicidade de duplas ligações conjugadas (Bianchini e Penteado, 1998). No procedimento experimental, os pimentões verdes, amarelos e vermelhos foram picados em pedaços pequenos. Foram pesados cerca de 30 g dos pedaços de cada pimentão, aos quais foram adicionados 10 ml de acetona e 50 ml de hexano. As misturas foram maceradas separadamente, em gral de porcelana com pistilo, e deixadas em repouso por 1 hora. Após esse período, as misturas foram filtradas em funil comum, com papel de filtro pregueado Whatmann nº 1 e, em seguida, as fases aquosas dos filtrados foram separadas em funil de separação, resultando cerca de 30 ml de cada uma das fases hexânicas. Sulfato de sódio anidro foi adicionado a essas fases orgânicas que, após filtração, foram concentradas até o volume de 1 ml, com aquecimento em banho-maria mantido a 70 ºC e sob agitação. O concentrado resultante de cada extrato foi aplicado em fita de papel preparada com papel de filtro Whatmann nº 1, com dimensões de 3,0 por 8,5 cm. Uma gota de cada amostra foi aplicada, com um capilar, próxima à base do papel (cerca de 1 cm acima da borda), cuidando para que o diâmetro da mancha não ultrapassasse 0,5 cm. A cuba cromatográfica foi preparada com um recipiente cilíndrico de vidro com tampa e contendo um pedaço de papel de filtro embebido com fase móvel, deixando a atmosfera interna do recipiente saturada com vapores da fase móvel para facilitar a "corrida" cromatográfica. Após a evaporação do solvente no qual a amostra estava diluída para aplicação, a fita de papel foi posicionada na cuba cromatográfica de modo que o nível da fase móvel ficasse abaixo do ponto onde a amostra havia sido aplicada. Os extratos aplicados foram eluídos com hexano com 5% de acetona e foram obtidos os cromatogramas 1, 2 e 3. Nos resultados e discussões do artigo, a extração dos pimentões com hexano: acetona 5:1 fornece extratos contendo os principais pigmentos dos pimentões: carotenos, criptoxantinas, capsantinas e capsorubina (Collera- Zuniga e cols., 2005). Os carotenos, como o beta-caroteno, têm pouca afinidade com a fase estacionária e maior afinidade com a fase móvel utilizada nesse experimento, contendo hexano com 5% de acetona, portanto, são eluídos com facilidade pela fase móvel e são os que, durante a "corrida" cromatográfica, mais se distanciam do ponto de aplicação da amostra. As criptoxantinas apresentam um grupamento hidroxila e têm moderada afinidade com a fase estacionária utilizada nesse experimento, já que a hidroxila pode formar ligações de hidrogênio com a água adsorvida no papel. Assim, as criptoxantinas e outras xantofilas apresentam certa tendência à retenção pela fase estacionária e, durante a "corrida" cromatográfica, distanciam-se moderadamente do ponto de aplicação da amostra. As capsantinas e a capsorubina são substâncias polioxigenadas e, portanto, têm maior afinidade com a fase estacionária da cromatografia em papel. Apresentam maior tendência à retenção pela fase estacionária e, durante a "corrida" cromatográfica, pouco se distanciam do ponto de aplicação da amostra. Em resumo, há três regiões em cada cromatograma dos extratos dos pimentões: a) a dos carotenos; b) a das xantofilas monooxigenadas; c) a das capsantinas e da capsorubina. Além disso, pode-se perceber que o cromatograma do pimentão amarelo apresenta principalmente carotenos, capsantinas, capsorubina e outras xantofilas mais polares; o do pimentão verde apresenta principalmente criptoxantinas e outras xantofilas de menor polaridade; o cromatograma do pimentão vermelho apresenta as três regiões intensas, indicando a presença de carotenos, criptoxantinas, capsantinas, capsorubina e outras xantofilas mais polares. Concluindo, a cromatografia em papel de extratos de pimentões permite a visualização da separação cromatográfica dos principais pigmentos existentes no extrato: os carotenos, as criptoxantinas, as capsantinas e a capsorubina. Além de despertar o interesse pela química de produtos naturais abordando carotenoides, o experimento dá margem a discussões elucidativas sobre interações intermoleculares, polaridade e funções orgânicas. A simplicidade do experimento torna sua realização viável em laboratórios que não dispõem de muitos recursos materiais. (NÚBIA MOURA E CAROLINA RODEIRO, 2008). 5. SEGUNDO ARTIGO CIENTÍFICO: APLICAÇÃO DA CROMATOGRAFIA EM PAPEL NA SEPARAÇÃO DE CORANTES EM PASTILHAS DE CHOCOLATE De acordo com artigo publicado por Leonardo Fernandes Fraceto e Sílvio Luís Toledo de Lima, este artigo descreve um experimento bastante simples, capaz de introduzir o estudante a um dos mais importantes métodos de separação, efetuado maciçamente em laboratórios de análises químicas em diferentes ramos da ciência: a cromatografia. A importância desse tema está na aliança entre duas facetas fundamentais da Química: interações intermoleculares e métodos de separação de componentes de uma mistura complexa. Aborda-se a separação de diferentes corantes alimentícios presentes em pastilhas de chocolate. 5.1. Resenha A cromatografia é um método de analise que ocupa um lugar de destaque em vários campos da ciência (Química, bioquímica, engenharia de alimentos etc) devido a sua praticidade de efetuar separações, permitindo identificar e quantificar variadas misturas de compostos químicos. Em toda cromatografia, distingue-se uma fase estacionária e uma fase móvel. A primeira consiste em uma substancia que absorve a mistura sob exame, a segunda é a substancia (geralmente liquida) que induz a migração da mistura. Existem vários tipos de cromatografia: em camada, em coluna, e em papel, entre outras. Trataremos aqui da cromatografia em papel, na qual uma tira de papel poroso é usado comma o suporte na fase estacionária. Seguindo os princípios que regem essa técnica, será demonstrado neste experimento como separar e analisa, utilizando a cromatografia em papel, corantes alimentícios em pastilhas de chocolate. Neste experimento, é possível observar que cada um dos corantes apresenta uma migração sobre o papel (fase estacionaria). No momento em que a fase móvel se desloca de maneira ascendente sobre o papel, há processos de interações intermoleculares entre os componentes em analise, os corantes e as duas outras substancias da fase estacionaria e da fase móvel. Em função das características de cada corante, ocorrera diferença entre as intensidades de interações. Caso um determinado corante apresente uma alta polaridade ocorrera uma interação maior com o papel (fase estacionário) do que com a solução da fase móvel, desta forma, a migração deste corante ocorrera mais lentamente se comparada a de um outro que apresenta uma polaridade menor. Este experimento pode ser usado também na identificação comparativa desses corantes artificiais de pastilhas de chocolate com os de outros produtos alimentícios como suco em pó e outros. (LEONARDO FERNANDES E SÍLVIO TOLEDO, 2003). 6. CONCLUSÃO Conclui-se então, que a cromatografia é um método de separação de substâncias que apresenta diversos procedimentos, dentre eles a cromatografia em papel. Esta, utiliza para a separação e identificação de tais substâncias, uma tira de papel filtro de qualidade especial, e se torna uma técnica eficiente e econômica por utilizar pequena quantidade de amostra e maior praticidade. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS COLLINS, C. H.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S. Introdução aos Métodos Cromatográficos, 7ª ed. Editora da UNICAMP. Campinas - SP, 1997. DEGANI, A. L. G.; CASS, Q. B.; VIEIRA, P. C. Química Nova na Escola, nº 07, pág. 21, 1998. CECCHI, H. M. Fundamentos Teóricos e Práticos em Análise de Alimentos, 2ª ed. rev. Editora Unicamp. Campinas - SP, 2009. RIBEIRO, N. M; NUNES, C. R. Química Nova na Escola, nº 03, pág.34 e 37, 2008. FRACETO, L. F; LIMA, S. L. Química Nova na Escola, v 18, pág.46 e 48, 2003. Disponível em: http://tinyurl.com/32vuzpx Acesso em: 11/11/2010. Disponível em: http://tinyurl.com/33bfhk8 Acesso em: 11/11/2010. Disponível em: http://www.pucrs.br/quimica/professores/arigony/cromatografia_FINAL/preparac ao_papel.htm Acesso em: 06/11/2010. Disponível em: http://www.iq.ufrgs.br/dqo/poligrafos/POLIGRAFO_004_%202010_2.pdf Acesso em: 11/11/2010. PEREIRA, A.; CAMÕES, F. Ciências Físico-Químicas, 10º ano. Texto Editores, 2004.