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Cromatografia
Método físico-químico para estabelecer determinada separação
Migração diferencial dos componentes de uma mistura
Fase estacionária --- Fase móvel
Inúmeras interações entre a fase móvel e a fase estacionária
Fase estacionária: Líquida ou sólida
Fase móvel: Líquida ou gasosa
Utilização:
Identificação de compostos, por padrões previamente existentes.
Purificação de compostos, separando-se substâncias indesejáveis.
Separação dos componentes da mistura.
1. Interação de troca iônica: matriz(fase estacionária) constituída por partículas com carga positiva ou negativa. A separação das proteínas depende de suas cargas elétricas.
2. Interação hidrofóbica: a matriz apresenta superfície hidrofóbica, retardando a migração das proteínas hidrofóbicas.
3. Filtração em gel: a matriz atua apenas como uma peneira, por onde as proteínas migram com velocidade variável, dependendo da forma e tamanho de suas moléculas.
4. Interação por afinidade: se baseia no fato de que muitas moléculas biológicas interagem com alto grau de especificidade, como acontece entre as enzimas e seus substratos, entre certos segmentos de DNA e RNA e entre antígenos e anticorpos. Técnica muito usada para purificação de anticorpos.
Eletroforese em gel
Os fragmentos de DNA formados com a ação das enzimas de restrição possuem tamanhos diferentes. A técnica de separação dos fragmentos de DNA mais utilizada é a eletroforese através de géis de agarose.
A agarose é um polissacarídeo (como ágar e pectina) que dissolve em água fervente e então gelifica quando esfria como a gelatina. Para realizar uma eletroforese, um gel de agarose é preparado, o DNA é introduzido em pequenos poços de gel, e então uma corrente elétrica é aplicada através do gel. Como oDNA é negativamente carregado, ele é atraído pelo eletrodo positivo. Entretanto, para chegar ao eletrodo positivo, o DNA deve migrar através do gel de agarose.
Os fragmentos de DNA menores podem migrar através de um gel de agarose mais rapidamente que os fragmentos de DNA maiores. A velocidade de migração de fragmentos de DNA lineares através da agarose é inversamente proporcional a log10 de seus pesos moleculares.
É possível calcular o tamanho exato de um dado fragmento com base na sua razão de migração. Após a eletroforese em gel, os fragmentos de DNA normalmente são corados com brometo de etídeo, que possui afinidade pelo DNA e fluorece (torna-se visível) vivamente em contato com a luz ultravioleta. Dessa forma pode-se localizar as bandas que correspondem ao DNA. Os fragmentos de DNA podem, então, ser isolados e purificados a partir dos géis de agarose.
Diálise
Processo físico-químico pelo qual duas soluções (de concentrações diferentes), são separadas por uma membrana semipermeável.
As substâncias em solução são separados por suas diferenças de peso molecular.
O transporte de solutos no processo dialítico ocorre por três mecanismos:
Difusão: é o fluxo de soluto de acordo com o gradiente de concentração.
Ultrafiltração: é a remoção de líquido através de um gradiente de pressão hidrostática ou pressão osmótica.
Convecção: é a perda de solutos durante a ultrafiltração.
