Controle Biológico Fitopatologia

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA - UFRA JOSEANI CASTRO DA SILVA SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. NO CONTROLE BIOLÓGICO DA QUEIMA-DA-BAINHA (Rhizoctonia solani Kühn) EM ARROZ (Oryza sativa L.). Belém-PA 2010 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA - UFRA JOSEANI CASTRO DA SILVA SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. NO CONTROLE BIOLÓGICO DA QUEIMA-DA-BAINHA (Rhizoctonia solani Kühn) EM ARROZ (Oryza sativa L.). Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Agronomia, área de concentração em Produção Vegetal, da Universidade Federal Rural da Amazônia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Agronomia. Orientadora: Prof. Dra. Gisele Barata da Silva Co-Orientadora: Dra. Denise Castro Lustosa Belém-PA 2010 Silva, Joseani Castro Seleção de isolados de Trichoderma spp. no controle biológico da queima-da-bainha (Rhizoctonia solani Kühn) em arroz (Oryza sativa L.)./ Joseani Castro da Silva. –Belém, 2010. 78 f.:il. Dissertação (Mestrado em Agronomia) – Universidade Federal Rural da Amazônia, 2010. 1. Arroz - microrganismos 2. Queima-da-bainha 3. Arroz controle biológico 4. Arroz – crescimento – promoção I. Título. CDD – 633.1899 MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DA AMAZÔNIA - UFRA JOSEANI CASTRO DA SILVA SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. NO CONTROLE BIOLÓGICO DA QUEIMA-DA-BAINHA (Rhizoctonia solani Kühn) EM ARROZ (Oryza sativa L.). Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Agronomia, área de concentração em Produção Vegetal, da Universidade Federal Rural da Amazônia, como requisito para obtenção do título de Mestre em Agronomia. Aprovada em 10 de março de 2010. COMISSÃO EXAMINADORA: ____________________________________ Dra. Kátia de Lima Nechet Embrapa Roraima ____________________________________ PhD. Marta Cristina Corsi Filippi Embrapa Arroz e Feijão _______________________________ Dra. Denise Castro Lustosa UFRA _______________________________ Dra. Gisele Barata da Silva Orientadora - UFRA AGRADECIMENTOS Primeiramente a Deus. A Professora Gisele Barata da Silva e a Dra. Denise Castro Lustosa pela orientação, dedicação e amizade. A secretária do Programa de Pós-graduação em Agronomia Gracy. Ao CNPq pelo apoio financeiro. Ao Engenheiro Agrônomo e esposo Walter Vellasco, pelo apoio profissional e companheirismo. Aos estagiários do Laboratório de Proteção de Plantas da UFRA: Darlyne, Arinaldo, Laudecir, Laureny, Moara, Claudeana, Michele, Jaqueline, Cintia, Marcela e Helem, não apenas pela participação efetiva neste trabalho, mas também pela amizade. Aos Engenheiros Agrônomos e amigos de trabalho Alessandra Moraes e Bruno Brabo pela grande amizade desde a graduação, e também auxílio nas atividades deste trabalho. Aos amigos e mestrandos do Programa de Pós-Graduação em Agronomia, Daniel Pinheiro, Patricia Maia e Érica Freire. As eternas amigas Vanessa Marques e Diana Castro. Aos meus pais Moraes e Ana Castro, meus irmãos e minha bonequinha Ana Clara. A todos que, de uma forma ou de outra, contribuíram para a realização deste trabalho. Muito obrigada. DEDICATÓRIA “...Dedico este trabalho aos meus queridos pais e heróis Moraes e Ana Castro, ao meu esposo Walter Vellasco, e a minha filha Ana Clara...” SUMÁRIO RESUMO ABSTRACT CAPÍTULO 1 1 INTRODUÇÃO GERAL 13 2 REFERENCIAL TEÓRICO 15 2.1 A CULTURA DO ARROZ 15 2.2 Rhizoctonia solani Kühn 16 2.3 QUEIMA-DA-BAINHA 17 2.4 Trichoderma spp. 19 2.4.1 MECANISMOS DE AÇÃO DE Trichoderma spp. 20 2.4.1.1 Micoparasitismo 20 2.4.1.2 Antibiose 20 2.4.1.3 Competição 21 2.4.1.4 Indução de resistência 21 2.4.1.5 Promoção de crescimento de plantas 22 REFERENCIAS 24 CAPITULO 2 31 SELEÇÃO DE ISOLADOS DE Trichoderma spp. COM POTENCIAL DE REDUÇÃO DE R. solani “IN VITRO” E DE PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO DE ARROZ 2.1 RESUMO 31 ABSTRACT 32 INTRODUÇÃO 33 2.2 MATERIAL E MÉTODOS 35 2.2.1 Isolados de Trichoderma spp. 35 Isolamento 35 2.2.2 Isolado de Rhizoctonia solani Kühn. 35 2.2.3 Confrontação direta 36 2.2.4 Interação de hifas 36 2.2.5 Produção de compostos tóxicos 36 2.2.6 Produção de compostos voláteis 37 2.2.7 Colonização de raiz de arroz por Trichoderma spp. 37 2.2.8 38 2.2.9 Efeito de Trichoderma spp. na germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de arroz Análise estatística 2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 39 2.3.1 Confrontação direta 39 2.3.2 Interação de hifas 41 2.3.3 Produção de compostos tóxicos 42 2.3.4 Produção de compostos voláteis 42 2.3.5 Colonização de raiz de arroz por Trichoderma spp. 44 2.3.6 Efeito de Trichoderma spp. na germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de arroz 45 2.4 CONCLUSÕES 51 REFERÊNCIAS 52 CAPITULO 3 57 39 CONTROLE DA QUEIMA-DA-BAINHA E PROMOÇÃO DO CRESCIMENTO EM PLANTAS DE ARROZ POR ISOLADOS DE Trichoderma spp. RESUMO 57 ABSTRACT: 58 3.1 INTRODUÇÃO 59 3.2 MATERIAL E MÉTODOS 61 Obtenção de inóculo de Rhizoctonia solani 61 Obtenção de isolados de Trichoderma spp. 61 Efeito da pulverização preventiva e curativa de isolados de 62 3.2.1 Trichoderma spp. sobre a queima-da-bainha do arroz 3.2.2 Avaliação do tratamento de sementes combinado a pulverização curativa de Trichoderma spp. no controle da queima-da-bainha do arroz. 63 3.2.3 Efeito do tratamento de sementes combinado a pulverização 63 curativa de Trichoderma spp. na promoção do crescimento de plantas de arroz 3.2.4 Efeito de Trichoderma spp. aplicado via tratamento de semente e 64 substrato contra Rhizoctonia solani em arroz 3.2.5 Análise estatística 64 3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 65 3.3.1 Efeito da pulverização preventiva e curativa de isolados de 65 Trichoderma spp. sobre a queima-da-bainha do arroz 3.3.2 Avaliação do tratamento de sementes combinado a pulverização 67 curativa de Trichoderma spp. no controle da queima-da-bainha do arroz. 3.3.3 Efeito do tratamento de sementes combinado a pulverização 69 curativa de Trichoderma spp. na promoção do crescimento de plantas de arroz 3.3.4 Efeito de Trichoderma spp. aplicado via tratamento de semente e 71 substrato contra Rhizoctonia solani em arroz 3.4 CONCLUSÕES 73 CONCLUSÕES GERAIS 74 REFERÊNCIAS 75 Figura 1 LISTA DE FIGURAS Diâmetro da colônia de Rhizoctonia solani em confrontação direta 40 com diferentes isolados de Trichoderma spp. Figura 2 Interação de hifas entre isolados de Trichoderma spp. e R.solani. Figura 3 Produção de compostos voláteis de diferentes isolados de 43 Trichoderma spp em relação ao crescimento micelial de Rhizoctonia solani Figura 4 Microbiolização de sementes de arroz tratadas com quatro isolados 44 de Trichoderma Figura 5 Germinação de sementes (%) de arroz tratadas com isolados de 48 Trichoderma spp Crescimento do hipócotilo (mm) (a) e radicula (mm) (b) em 49 sementes tratadas com Trichoderma spp. Figura 6 Figura 7 Figura 8 Figura 9 Figura 10 Severidade da queima-da-bainha (Rhizoctonia solani) com pulverizações preventiva e curativa de quatro isolados de Trichoderma spp. Área Abaixo da curva de progresso (ASCPD) da queima-da-bainha em plantas de arroz pulverizadas com quatro isolados de Trichoderma spp. 41 66 67 Severidade da queima-da-bainha (Rhizoctonia solani) em plantas 68 tratadas via semente com três diferentes períodos de pulverizações foliares curativas de quatro isolados de Trichoderma spp. Área Abaixo da curva de progresso (ASCPD) da queima-da-bainha em plantas 68 tratadas via semente com três diferentes períodos de pulverizações foliares de quatro isolados de Trichoderma spp. Figura 11 Severidade da queima-da-bainha (Rhizoctonia solani) em plantas tratadas com quatro isolados de Trichoderma spp. em diferentes métodos de veiculação 71 Figura 12 Área sob a curva de progresso (ASCPD) da queima-da-bainha em plantas tratadas com quatro isolados de Trichoderma spp. em diferentes métodos de veiculação 72 LISTA DE TABELAS Tabela 1 Germinação de sementes (%) de arroz tratadas com 46 Trichoderma spp. Tabela 2 Efeito do tratamento de sementes combinado a pulverização curativa de Trichoderma spp sobre a promoção do crescimento de plantas de arroz . 70 RESUMO: A queima-da-bainha causada pelo fungo Rhizoctonia solani Kühn é uma das mais importantes doenças da cultura do arroz irrigado. O uso de microrganismos antagônicos com eficiente potencial sobre a queima-da-bainha gera perspectivas no controle da doença. Fungo do gênero Trichoderma é uma alternativa viável não apenas no controle de doenças, mas também na promoção do crescimento de plantas. O objetivo deste trabalho foi selecionar isolados de Trichoderma spp. provenientes da floresta Amazônica capazes de reduzir a severidade da queima da bainha e promover o crescimento de plantas de arroz. Foram avaliados in vitro 13 isolados de Trichoderma, quanto à produção de compostos tóxicos, produção de compostos voláteis, confrontação direta, interação de hifas e seu efeito na germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas. Em condições de casa-de-vegetação foram realizados quatro experimentos inteiramente ao acaso, com quatro isolados de Trichoderma que constaram de, efeito da pulverização preventiva e curativa de isolados de Trichoderma; tratamento de sementes combinado a pulverização curativa no controle da doença e promoção do crescimento de plantas de arroz; e efeito de Trichoderma spp. aplicado via tratamento de semente e substrato contra Rhizoctonia solani em arroz. As avaliações constaram da severidade da doença, com base no comprimento da lesão no perfilho principal, comprimento e massa seca de raiz e parte aérea. Foi calculado a área sob curva de progresso da doença (ASCPD) a partir de cinco avaliações da severidade. In vitro, todos os isolados de Trichoderma spp. reduziram o crescimento micelial de R. solani, destacando-se T.06, T.09, T.12, T.52. e T.a. Os isolados avaliados não afetaram negativamente a germinação de sementes de arroz. A severidade e ASCPD da queima da bainha foram reduzidas significativamente pelos isolados de Trichoderma (T.06, T.09, T.12 e T.52) quando pulverizados preventivamente, ocorrendo o mesmo ao tratar substrato e sementes com Trichoderma via pó e suspensão, exceto para os tratamentos T.09 M2 e M3 e T.12 M1 e M2 que não reduziram a ASCPD. O tratamento de sementes combinado com a pulverização curativa de isolados de Trichoderma também reduziram a severidade, ressaltando que o isolado T.52 proporcionou maior comprimento de parte aérea e o T.12, destacou-se pelo o aumento da massa seca em relação à testemunha, não ocorrendo incremento no comprimento de raiz por nenhum dos isolados de Trichoderma. Os isolados de Trichoderma T.06, T.09, T.12 e T.52 foram promissores na redução da queima da bainha em arroz em condições de casa de vegetação. Palavras-chave: arroz, microrganismos, promoção do crescimento. queima-da-bainha, controle biológico, ABSTRACT: The sheath blight caused by Rhizoctonia solani Kühn fungus it‟s one of the most important diseases from the irrigated rice culture. The use of antagonistic microorganisms with efficient potential over the sheath blight creates perspectives on the disease control. A fungus of Trichoderma kind it‟s a viable alternative not only in the diseases control, but also in the promotion of plants growing. The objective of this work was to select isolates of Trichoderma spp. from the Amazon forest capable of reducing the roughness of the sheath blight and promote the rice plants growth. Where available in vitro 13 isolates of Trichoderma, as the toxic products production, volatile compounds production, straight confrontation, hyphae interaction and it‟s effects on the seeds germination and seedlings development. In house of vegetation were realized four experiments entirely at random, with four Trichoderma isolates that consist from effect off preventive pulverization and healing of Trichoderma isolates; seeds treatment combined to healing pulverization on disease control and promoting the rice plant growth.; and Trichoderma spp. effect applied over the seed treatment and subtract against Rhizoctonia solani in rice. The evaluations consist on the severity of disease, based on the injury‟s length, length and dry mass of the root and aerial part. The area of the progress curve of the disease (ASCPD) was calculated, from five evaluations of severity. In Vitro, all the Trichoderma spp. isolates had reduced the mycelial of R. solani, highlighting the T.06, T.09, T.12, T.52. and T.a. The evaluated isolates haven‟t negatively affected the germination of the rice seeds. The roughness and ASCPD of the sheath blight were significantly reduced by the Trichoderma (T.06, T.09, T.12 and T.52) isolates when pulverized preventively, occurring the same by treating the substratum and seeds with Trichoderma by way of dust and suspension, except for the treatments T.09 M2 e M3 and T.12 M1 and M2 that wont reduce the ASCPD. The seed treatment combined with the healing pulverization of Trichoderma isolates that also reduce the severity emphasizing that the isolate T.52 provided greater length of the aerial part and the T.12, stood out by the increase of the dry mass related to the spectator not occurring increase on the root length by any of the Trichoderma isolates. The Trichoderma T.06, T.09, T.12 and T.52 isolates were promising on reducing the sheath blight on the rice in conditions of house of vegetation. Keywords: rice, microorganisms, sheath blight, biological control, promoting growth. 13 CAPÍTULO 1 1- INTRODUÇÃO GERAL O arroz (Oryza sativa L.) é um dos cereais mais cultivados e consumidos no mundo (BORGES et al., 2008), sendo considerada uma cultura de grande importância econômica, movimentando de maneira efetiva sua cadeia produtiva. Considerado um alimento saudável, o arroz possui uma composição em proteínas (aminoácidos essenciais) mais adequada em termos nutricionais que a de outros cereais, apresenta fonte primária de energia advinda de carboidratos complexos, além do baixo teor de gordura do arroz, rica em ácidos graxos insaturados (NAVES e BASSINELLO, 2006). É o principal produto da cesta básica do brasileiro, o qual destina cerca de 22% do seu orçamento em alimentação. Na Região Norte, o cultivo do arroz é importante em vários Estados, como Amapá, Roraima, Tocantins e Pará. O Estado do Pará ocupa o segundo lugar em quantidade produzida, equivalente a 29%, com produção de 292 mil toneladas em uma área de 153 mil ha, com produtividade inferior a dois mil kg.ha-1 (IBGE, 2009). Como fator limitante, a orizicultura enfrenta a ocorrência de doenças provocadas por patógenos, como a queima-da-bainha, doença fúngica do colmo e bainha em arroz irrigado, que causa danos expressivos na produtividade (FILIPPI; PRABHU e SILVA, 2004). A doença é causada por Rhizoctonia solani J.G. Kuhn, fungo que sobrevive saprofiticamente no solo, geralmente encontrando nas camadas superficiais do perfil do solo, principalmente nos primeiros 10 cm, devido à dependência de oxigênio (CARDOSO, 1994). A incidência da queima-da-bainha resulta em seca parcial ou total das folhas e provoca acamamento da planta (EMBRAPA, 2004). Na região norte, Bedendo e Prabhu, (2005) afirmam que, em todas as lavouras orizícolas do Estado do Tocantins, ocorrem à doença, em maior ou menor grau de severidade, assumindo importância relevante para a região. A queima-da-bainha é uma doença de difícil controle, uma vez que, o patógeno forma escleródios (estruturas de resistência), conferindo ao fungo a capacidade de sobrevivência, além de possuir ampla gama de hospedeiros (PRABHU et al., 2002; RODRIGUES et al., 2003; NUNES; RIBEIRO e TERRES, 2004). Práticas culturais antes, durante e depois do cultivo, são fatores que devem ser levados em consideração para obter o melhor desempenho da cultura, como destruir restos culturais e drenar as áreas durante a entressafra. Nagarajkumar; Bhaskaran e Velazhahan (2004), afirmam que, o controle químico pode resultar no surgimento de populações resistentes do patógeno. Por outro lado, a prioridade dos programas de melhoramento genético do arroz continua sendo a brusone. Assim, não há entre 14 as cultivares recém lançadas, genótipos resistentes ou moderadamente resistentes a queimada-bainha (RODRIGUES et al., 2003). Entretanto, a severidade tem aumentado na última década de modo significativo nas lavouras de produtores na região norte do país (PRABHU; et al, 2002). Portanto faz-se necessária a busca por outros métodos de controle da queima da bainha, sendo o controle biológico, através do tratamento de sementes e pulverizações em plantas, uma alternativa viável. Segundo Bomfim (2007), diversos fungos têm atividade comprovada como agentes de biocontrole, destacando-se o fungo do gênero Trichoderma, que apresenta como principais mecanismos de ação, antibiose, parasitismo, competição e indução de resistência (MELO, 1998). Diante da importância que a queima-da-bainha representa para a cultura do arroz no norte do Brasil, torna-se necessário conhecer o efeito do controle biológico de isolados de Trichoderma spp. oriundos da região Amazônica. Diante do exposto, o presente trabalho teve como objetivo selecionar isolados de Trichoderma spp. provenientes da floresta Amazônica capazes de reduzir a severidade da queima da bainha e promover o crescimento de plantas de arroz em condições de casa de vegetação. 15 2- REFERENCIAL TEÓRICO 2.1- A CULTURA DO ARROZ O arroz (Oryza sativa L.) é um cereal originário da Ásia e está amplamente disperso por todas as regiões tropicais e temperadas do mundo, é cultivado em vários continentes e ambientes, como várzeas inundadas e terras altas, adaptando-se em diversas regiões (EMBRAPA, 2004). A cultura do arroz foi, provavelmente, a primeira planta cultivada na Ásia e na Europa, sendo seu cultivo iniciado nos séculos VII e VIII e no Brasil, foi introduzida no final do século XIX por imigrantes europeus (ALVARENGA et al., 2005) tornando-se uma das atividades mais importantes na economia brasileira, tanto pelo seu valor econômico quanto pela geração de empregos. Sendo cultivado e consumido em todos os continentes, o arroz apresenta elevada produção e significativa área de cultivo. É considerado o principal alimento do mundo, por ser a base da alimentação de metade da população mundial. Estimativas apontam que até 2050, a produção mundial deverá ser dobrada para atender a demanda da população (GUIMARÃES et al., 2006). Segundo Alonço et al. (2006), cerca de 150 milhões de hectares dessa cultura seriam cultivados anualmente no mundo, produzindo 590 milhões de toneladas. As estimativas apontam que em 2009/10 a produção mundial teria um crescimento inferior a 1% ao ano, enquanto o consumo ficaria acima de 1%, ajustando dessa forma, o quadro de oferta e demanda (INSTITUTO RIO GRANDENSE DO ARROZ, 2008). O arroz é o principal produto da cesta básica do brasileiro, o qual destina cerca de 22% do seu orçamento em alimentação. A produção brasileira é destinada ao consumo interno, e o seu consumo médio é de 75 kg/habitante/ano. Na safra 2008/2009, a área plantada foi de aproximadamente três milhões de hectares, com produção de mais de 12 milhões de toneladas e produtividade média de 4,4 kg.ha-1 (IBGE, 2009). A maior parcela da produção de arroz do país é proveniente do ecossistema de várzeas, onde a orizicultura irrigada é responsável por 69% da produção nacional. Neste contexto, a disponibilidade de várzeas, as características dos solos e as condições de hidromorfismos adequadas, tornam a região tropical apta à orizicultura irrigada. Nos últimos anos o cultivo nesta região vem crescendo de maneira considerável, por apresentar fatores favoráveis à boa 16 produtividade, como as condições climáticas das várzeas, que permitem o cultivo do arroz durante o ano todo, portanto maior produção anual de fitomassa quando comparada com várzeas da região subtropical (GUIMARÃES et al., 2006) A orizicultura, assim como outras culturas agrícolas, também enfrenta como fator limitante a ocorrência de doenças provocadas por patógenos, que podem reduzir o potencial produtivo das cultivares. Dentre essas destaca-se a queima-da-bainha, doença fúngica do colmo e bainha em arroz irrigado, com potencial para causar danos expressivos na produtividade de arroz (FILIPPI; PHABHU e SILVA, 2004) 2.2- Rhizoctonia solani Kühn Rhizoctonia solani J.G. Kühn [teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) Donk], pertence ao grupo de anastomose AG-1 e ao grupo intraespecífico 1-A, é um patógeno habitante do solo, apresentando micélio bem desenvolvido, septado que ramifica-se em ângulo de 45º a 90º graus (BEDENDO e PRABHU, 2005). A habilidade saprofítica competitiva, a capacidade de formar estruturas de resistência, o potencial patogênico e a vasta gama de hospedeiros tornam R.solani um patógeno economicamente importante (MENZIES, 1970). Solos com elevado percentual de matéria orgânica, altos níveis de nitrogênio e fósforo apresentam-se favoráveis ao patógeno, assim como, temperatura em torno de 28 °C e elevada umidade (BEDENDO e PRABHU, 2005). A produção de escleródios, estrutura de resistência globosa com diâmetro de aproximadamente 2 mm, inicialmente de cor branca tornando-se marrom ao longo do tempo (INSTITUTO BIOLÓGICO DE SÃO PAULO, 2007), também aumenta o potencial de R. solani. Através dessas estruturas o patógeno sobrevive no solo e em plantas doentes por longos períodos sob condições adversas, pois possui a capacidade de resistir à degradação química e biológica (ABO ELLIL, 1999). São diversas as culturas hospedeiras de R. solani, como cenoura, alface, feijão, soja, eucalipto, entre outros, permitindo que o patógeno persista no solo por longo período. É um patógeno com grande capacidade de sobrevivência e ampla gama de hospedeiros (PRABHU; FILIPPI e RIBEIRO, 1999), ou seja, a rotação de culturas com espécies hospedeiras e ainda, o 17 cultivo contínuo do arroz na mesma área, aumentam os danos, uma vez que, os restos de cultura contribuem para o aumento do inóculo inicial (LEE E RUSH, 1992). 2.3- QUEIMA-DA-BAINHA No Brasil a ocorrência da queima-da-bainha foi identificada pela primeira vez em lavouras de arroz de alguns municípios do Estado de São Paulo, em 1967 (AMARAL et al., 1979). Posteriormente foi observada no Rio Grande do Sul (RIBEIRO e TANAKA, 1984) e no Estado do Amazonas (SANTOS e GALVÃO, 1989). Esta doença é responsável por danos crescentes a cada ano na cultura do arroz (LUDWIG e MOURA, 2007). Os sintomas iniciam por lesões na bainha, na altura da lâmina de água, e em condições favoráveis a doença pode alcançar folhas superiores (OU, 1985). O fungo forma estruturas de resistência, os escleródios que sobrevivem no solo são disseminados pela água de irrigação, infectando folhas e bainhas até a base da haste (RABINDRAN e VIDHYASEKARAN, 1996). Tais estruturas sobrevivem até dois anos e multiplicam-se no solo, com o tempo, flutuam na água e se acumulam ao redor da planta, causando infecção inicial nos colmos, disseminandose rapidamente, através da infecção por hifas, para as partes superiores (ALONÇO et al., 2006). A infecção tem início quando escleródios, disseminados pela água da cultura irrigada, atingem partes de plantas e germinam sobre a superfície vegetal, onde a penetração pode ocorrer através dos estômatos ou diretamente através da cutícula, então o micélio desenvolvese rapidamente no interior e na superfície externa dos tecidos, levando ao aparecimento de manchas, sobre as quais podem ser encontradas hifas e escleródios, caracterizando-se inicialmente por manchas circulares, elípticas ou ovaladas, de coloração verde-acinzentada (AGRIOS, 2005). As lesões encharcadas aparecem nas bainhas ao nível da água e, posteriormente, aumentam de tamanho e apresentam-se rodeadas por bordadura irregular e marrom, provocando o acamamento da planta (RIBEIRO e TANAKA, 1984). Os escleródios são novamente disseminados pela água da irrigação (BEDENDO e PRABHU, 2005). As fontes primárias de infecção são as sementes e os escleródios presentes em solos infeccionados. A lâmina d‟água permite o movimento dos escleródios, os quais entram em contato com o colmo do arroz, revestido por bainhas. Neste ponto, os escleródios germinam e as hifas iniciam a colonização dos colmos, incluindo as folhas e as plantas adjacentes sob condições de baixa luminosidade, umidade em torno de 95% e altas temperaturas, de 28 a 18 32C (OU, 1985). A queima-da-bainha altera o equilíbrio de síntese e da decomposição de pigmentos de clorofila nas folhas e taxa de fotossíntese (NAIDU; RAO e MURTY, 1981) reduz o comprimento da panícula, aumenta número de espiguetas vazias que variam em torno de 12%, e a massa de grãos/panícula (ARAÚJO e ARAÚJO, 2006). A alta adubação nitrogenada, a elevada densidade de plantas e a suscetibilidade das cultivares são fatores responsáveis pela alta severidade da doença em diferentes países (LEE e RUSH, 1992), inclusive no Brasil (PRABHU et al., 2002; RODRIGUES et al., 2003). Práticas culturais antes, durante e depois do cultivo, são fatores que devem ser levados em consideração para obter o bom desenvolvimento da cultura. O uso de fungicidas é um método complementar e eficiente no controle das doenças, principalmente naquelas lavouras com histórico de danos freqüentes e sob condições climáticas muito favoráveis à sua ocorrência. Porém vale ressaltar que, o emprego adequado das práticas de manejo implica em menor uso de fungicidas e contribui para a preservação da qualidade do ambiente e da saúde humana, além de reduzir o custo de produção e aumentar a produtividade e sustentabilidade da lavoura orizícola (FUNCK e KEMPF, 2008). As técnicas utilizadas para controle da doença consistem em realizar um adequado manejo das áreas afetadas, realizando boa drenagem na entressafra, utilizar densidade de semeadura recomendada (120-150 kg ha-1), adubação de acordo com análise de solo, uso racional de herbicidas e rotação com outras gramíneas como milho e sorgo, e ainda o tratamento de sementes com agentes biológicos como Trichoderma sp., Gliocladium sp. e Bacillus sp., sendo Trichoderma eficiente no controle da queima-da-bainha em nível experimental no Rio Grande do Sul (PRABHU; FILIPPI e RIBEIRO, 2006). Portanto faz-se necessária a busca por outros métodos de controle, sendo o controle biológico uma alternativa promissora da queima da bainha do arroz. Agentes de controle biológico são capazes de se estabelecer, colonizar e dispersar no ecossistema (ÁVILA et al., 2005). Tais agentes constituem alternativa para diminuir o potencial de inóculo de patógenos habitantes do solo, sem trazer danos ao meio ambiente (MELLO et al., 2007). Os fungos do gênero Trichoderma são de grande importância econômica para a agricultura, uma vez que são capazes de atuarem como agentes de controle de doenças de várias plantas cultivadas, promotores de crescimento e indutores de resistência de plantas à doença (MOHAMED e HAGGAG, 2006). Algumas linhagens desses fungos vêm recebendo grande atenção da pesquisa, também, por sua versatilidade de ação. Estas são capazes de produzir enzimas que degradam paredes celulares de outros fungos e produzem 19 também substâncias antifúngicas (antibióticos), apresentam diversidade de estratégias de sobrevivência que as tornam altamente competitivas no ambiente e extraordinária capacidade de proliferação na rizosfera (MELO 1996, RESENDE et al., 2004). Ademais, certos isolados se mostram resistentes aos fungicidas, característica que os fazem potenciais agentes biorremediadores (RESENDE et al., 2004). A literatura disponível demonstra que os fungos desse gênero possuem amplas possibilidades para aplicação, tanto no biocontrole, de patógenos foliares, quanto de patógenos habitantes do solo (LOUZADA et al., 2009). Diante deste contexto, o controle biológico torna-se uma importante ferramenta no combate à queima-da-bainha, buscando uma agricultura sustentável (MICHEREFF; PERUCH e ANDRADE, 2005). Levando a resolução de problemas relacionados à ocorrência de doenças de plantas, com base na conservação dos recursos naturais, aumento da diversidade biológica, redução no uso de agrotóxicos e maximização da produtividade (THURSTON, 1992). 2.4- Trichoderma spp. No controle biológico de doenças causadas por patógenos de solo, os fungos são os principais agentes antagônicos. Micoparasitas como fungos do gênero Trichoderma [teleomorfo Hypocrea sp.], pertencente à família Hypocreaceae, o qual forma estruturas de sobrevivência como os clamidósporos, têm sido considerados eficazes no biocontrole de fitopatógenos. Principalmente de fitopatógenos que apresentam estruturas de resistência consideradas difíceis de serem atacadas, como esporos, escleródios, clamidósporos e microesclerócios (MELO, 1996). Segundo Mukherjee et al. (1995) Trichoderma spp. apresenta diversas vantagens do seu uso quando comparado com outros agentes de biocontrole, como parasitas de hifas e escleródios de Rhizoctonia sp. podendo reduzir sua sobrevivência; adaptam-se em temperatura entre 15º e 35ºC (temperatura ótima: 25°C), umidade em torno de 70% (podendo desenvolver-se entre 20 e 80%) e pH em torno de 6 à 6.5 (NORTE, 2008). É um fungo anaeróbio facultativo, o que lhe confere a capacidade de atuar tanto em condições aérobias (solos muito porosos), cujas condições são ótimas para seu crescimento, como em meios com elevada atividade microbiana, pontualmente deficientes em oxigênio. No Brasil existem diversos produtos comerciais à base de Trichoderma, como: Trichodermil, possuindo como i.a T.harzianum, que atua sobre vários patógenos de diferentes 20 culturas, como no controle de R. solani em feijão; e Tricovab a base de T. stromaticum utilizado no controle de Crinipellis perniciosa, causador da vassoura-de-bruxa do cacaueiro. Fungos do gênero Trichoderma podem atuar por diferentes mecanismos de ação, como: antibiose, parasitismo, competição e indução de resistência (MELO, 1998). A determinação desses efeitos depende de muitas interações que ocorrem no solo entre Trichoderma spp. raízes da planta e outros microorganismos (ASKEW e LAING, 1993, PORRAS et al., 2007). 2.4.1- MECANISMOS DE AÇÃO DE Trichoderma spp. 2.4.1.1- Micoparasitismo O micoparasitismo (hiperparasitismo) consiste em um processo em que o microrganismo parasita o outro, estes atacam hifas e estruturas de reprodução e sobrevivência dos patógenos de planta, reduzindo a infecção e o inóculo do patógeno. A relação hospedeiroparasita é caracterizada por um período relativamente longo de contato, que pode ser físico ou metabólico com digestão por enzimas hidrolíticas, como, quitinases, proteases, glucanases e lipases (BETTIOL, 1991; MELO e FAULL, 2000). Trichoderma spp. possui característica micoparasita desenvolvendo-se em direção as hifas de outros fungos, presumivelmente em resposta a estímulos químicos produzidos pela hifa hospedeira, enrola-se fortemente em toda a sua extensão para, então, penetrar e digerir a hifa (SILVA, 1997; MELO,1998). Em trabalho realizado por Lucon (2009), isolados de Trichoderma spp. proporcionaram total supressão de R. solani em mudas de pepino. 2.4.1.2- Antibiose Antibiose é definida como uma interação entre organismos, na qual um ou mais metabólitos, produzidos por um organismo, têm efeito danoso sobre o outro (BETTIOL, 1991). As espécies de Trichoderma têm sido estudadas por produzirem uma série de enzimas extracelulares (MENEZES e SOUZA, 1995); por degradarem paredes de células fúngicas e 21 por serem ativas na produção de metabólitos extracelulares com atividade antimicrobiana (MELO, 1991) que, segundo Harman et al. (2004), chegam a mais de 100. Algumas espécies de Trichoderma caracterizam-se por apresentarem alta produção de substâncias gasosas de origem antibiostática com característico aroma de côco. Os metabólitos produzidos podem ser voláteis e não-voláteis. Dos antibióticos produzidos por Trichoderma, Bastos (1991) cita gliotoxina, viridina, trichodermina, suzucacilina, alameticina e dermadina, os quais têm a capacidade de inibir o desenvolvimento de vários fungos. De acordo com Roberts e Lumsden (1990), a gliotoxina é responsável pela inibição da germinação de esporângios e do crescimento micelial de Pythium ultimum. 2.4.1.3- Competição Competição é um processo referente à interação entre dois ou mais organismos, empenhados na mesma ação. A competição entre microrganismos ocorre principalmente por nutrientes, espaço e oxigênio, colonizando rapidamente o substrato, não podendo ser colonizando por outro microrganismo (BETTIOL, 1991; BAKER e DICKMAN, 1993, ETHUR, 2006) e, mesmo sendo um mecanismo importante, é extremamente difícil de ser comprovado experimentalmente, o que não ocorre com a antibiose e o micoparasitismo (HARMAN, 2000). Segundo Harman et al. (2004), Trichoderma spp. compete pelos exsudados liberados pelas sementes no processo de germinação que estimulam a germinação de propágulos de fungos fitopatogênicos. De acordo com Howell (2005), a competição é uma das principais características de isolados de Trichoderma usados como agentes de biocontrole, pois somente assim tem a capacidade de se desenvolver na rizosfera. 2.4.1.4- Indução de resistência A indução de resistência é outro mecanismo utilizado por agentes de biocontrole, como Trichoderma spp. Esse processo ocorre quando as plantas expostas a um agente indutor têm seus mecanismos de defesa ativados, não apenas no sítio de indução como também em outros locais dele distantes, de forma mais ou menos generalizada (ROMEIRO, 1999). Tem 22 ocorrido muito progresso na elucidação dos caminhos que envolvem a indução de resistência, sendo que, em muitos casos, o ácido salicílico e o ácido jasmônico, juntamente com o etileno ou óxido nitroso, induzem a cascata de eventos que provoca a produção de uma grande variedade de metabólitos e proteínas com diversas funções na planta, modificando o proteoma vegetal (HARMAN et al., 2004, ETHUR, 2006). 2.4.1.5- Promoção de crescimento de plantas A promoção de crescimento ocasionada por microrganismos do solo ocorre devido à ação de vários fatores. Pode envolver produção de hormônios vegetais, produção de vitaminas ou conversão de materiais a uma forma útil para a planta, absorção e translocação de minerais e controle de patógenos (MELO, 1996). Trichoderma atua como biostimulante do crescimento radicular, pois promove o desenvolvimento de raízes devido à secreção de fitohormônios, o que permite, devido ao incremento da massa radicular, uma melhor assimilação de nutrientes e água aumentando a resistência em situações de estresse. Além de facilitar a solubilização e absorção de nutrientes pelas plantas (HARMAN, 2000; HARMAN et al., 2004). O isolado T-22 de T.harzianum promoveu o crescimento em plantas, através da sua habilidade em solubilizar muitos nutrientes importantes para a mesma (ALTOMARE et al., 1999). A interferência de Trichoderma spp. no crescimento de plantas e o aumento na produtividade ocorrem, segundo Harman et al. (2004), devido à sua capacidade em colonizar as raízes. O isolado T-22 de T. harzianum foi efetivo na indução de formação de raízes em tomateiro, promoveu o incremento no comprimento de raízes de soja e milho e o aumento da produtividade de pimentão tanto quanto um hormônio comercial (HARMAN, 2000). Sivan e Harman (1991), tratando sementes de milho e algodão com os isolados T12, T95 e T22 (fusão dos dois anteriores) de T. harzianum observaram que o isolado T22 aumentou em 31 % em milho e 60 % em algodoeiro o crescimento das raízes, em relação à testemunha. Essa mesma espécie de Trichoderma quando aplicada na forma de suspensão de conídios no solo proporcionou aumento de massa seca em feijoeiro de 10 %, no rabanete de 8%, no tomateiro de 37 %, na pimenteira de 42 % e no pepineiro de 93 % (CHANG et al., 1986). Também foram encontrados resultados positivos por Inbar et al. (1994), em tratamento de solo com isolado de T. harzianum, nos quais o pepineiro e pimenteira tiveram aumento 23 significativo quanto à altura das plantas em 24 e 17 %, e peso de massa seca em 25 e 29 %, respectivamente. Isolados de Trichoderma spp. podem agir como promotores de crescimento, mesmo na presença de fungos micorrízicos. Calvet; Pera e Barea (1993), utilizando tratamentos com a aplicação dos fungos micorrízico Glomus mosseae, antagonista T. aureoviride e o fitopatógeno Pythium ultimum em Tagetes erecta, observaram que G. mosseae + T. aureoviride aumentaram a massa seca em 100 % e a área foliar em 55 %. A contribuição de Trichoderma spp. na germinação também é comprovada por vários autores. Kleifeld e Chet (1992) observaram ação positiva de isolado de T. harzianum em tratamento de semente e de solo na germinação de feijão em 77 e 100%, rabanete em 58 e 100%, tomate em 100 e 70 %, pimenta em 90% e pepineiro 90 e 100 %, respectivamente, evidenciando que as variações nos resultados podem ser decorrentes da forma de tratamento e da cultura. Por outro lado, em alface alguns isolados de T. harzianum inibiram a germinação de sementes (OUSLEY et al., 1994) 24 REFERÊNCIAS ABO ELLIL, A. H. A. Oxidative stress in relation to lipid peroxidation, sclerotial development and melanin production by Sclerotium rolfsii. 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Os isolados mais promissores foram avaliados quanto aos seus efeitos na germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de arroz, avaliaram-se respectivamente, a colonização de Trichoderma spp. sobre raízes das plântulas e, germinação de sementes. Determinou-se o percentual de germinação normal e anormal, número de sementes mortas, comprimento da radícula e do hipocótilo. Os ensaios ocorreram em delineamento inteiramente casualizado, variando de três a quatro repetições. Todos os isolados de Trichoderma spp. reduziram o crescimento micelial de R. solani, destacando-se T.06, T.09, T.12, T.52 e T.a. Nenhum isolado afetou negativamente a germinação de sementes de arroz e T.a proporcionou maior desenvolvimento do hipocótilo, juntamente com os isolados T.12 e T.52 via pó; os isolados T. 47 e T.a via suspensão, não afetaram o desenvolvimento radicular de plântulas de arroz. Palavras-chave: Trichoderma spp., Thanatephorus cucumeris, Oryza sativa, antagonismo, microbiolização. 32 CHAPTER 2 SELECTION OF Trichoderma spp. ISOLATES WITH POTENTIAL OF REDUCTION OF R. solani “IN VITRO” AND OF PROMOTE THE GROWTH OF RICE. ABSTRACT: The Objects of these work were to select Trichoderma spp. isolates from Coari-AM, possible agents of Rhizoctonia solani Kühn biocontrol, causer of sheath blight on rice, verifying the potential from the them on raising the germinal power of seeds and propose a better development of seedlings. Were realized four test in vitro with the T.06, T.09, T.07, T.12, T.13, T.20, T.21, T.34, T.42, T.46, T.47, T.52, T.09 and T.a, isolates and these being direct confrontation, hyphae interaction, production of toxic compounds and production of volatile compounds. The isolates most promissory were evaluated due to its effects on the seeds germination and development of rice seedlings were evaluated respectively the colonization of Trichoderma spp. about roots of seedlings and seeds germination. Was determined the percentage of normal and abnormal dead seeds percentage radicle and hipocolito length. The tests occurred in lineation entirely randomized ranging from three to four repetitions. All the Trichoderma spp. isolates had reduced the mycelial growth of R. solani being distinguished T.06, T.09, T.12, T.52. and T.a. Any of the isolates affected negatively the rice seeds germination and T.a. provided a major development of hipocolito both with isolates T.12 and T.52 by way of dust, the isolates T.47 and T.a by way of suspension hasn‟t affected the radicle development of rice seedlings. Keywords: Trichoderma spp., Thanatephorus cucumeris, antagonisms, microbiolization, Oryza sativa. 33 2.1 INTRODUÇÃO O arroz (Oryza sativa L.), um dos cereais mais cultivados e consumidos no mundo, movimenta de maneira expressiva sua cadeia produtiva. A produtividade desta cultura é afetada por diversos fatores, como doenças fúngicas responsáveis por significativos danos (BALARDIN e BORIN, 2001). Causada por Rhizoctonia solani Kühn, a queima-da-bainha, importante doença da cultura do arroz, causa severos danos em arroz irrigado, ocorre geralmente nos colmos e bainhas, caracterizando-se inicialmente por manchas circulares, elípticas ou ovaladas, de coloração verde-acinzentada, estas lesões aparecem nas bainhas ao nível da água e, posteriormente, aumentam de tamanho e apresentam-se rodeadas por bordadura irregular e de coloração marrom, provocando o acamamento da planta (RIBEIRO e TANAKA, 1984). O controle biológico de doenças fitopatogênicas é capaz de suprimir doenças e promover o crescimento das plantas cultivadas (THOMASHOW, 1996) e ainda reduzir ou substituir o uso de produtos agroquímicos, na produção de alimentos (FREITAS e AGUILAR-VILDOSO, 2004). O uso de agentes de biocontrole (ACB) requer uma interrupção de algum estágio da doença ou do ciclo de vida do fitopatógeno, a qual pode ocorrer através de diversos mecanismos. A prevenção da infecção, redução na colonização do tecido hospedeiro, redução da esporulação ou da sobrevivência do fitopatógeno podem proporcionar diferentes níveis de controle através da utilização de agentes biológicos (PUNJA e UTKHEDE, 2003). Dentre os organismos capazes de realizar o controle de fitopatógenos, destaca-se o fungo do gênero Trichoderma, documentado como antagonista de sucesso à patógenos habitantes de solo, como: R. solani; Sclerotium rolfsii; Sclerotinia sclerotiorum; Fusarium spp. e Pythium spp. (CORABI-ADELL, 2004). Outro benefício gerado por Trichoderma é a promoção do crescimento de plantas que está relacionada com sua capacidade de produção de hormônios vegetais, absorção e translocação de minerais, solubilização de fosfastos e controle de patógenos (MELO, 1996; HOYOS-CARVAJAL; ORDUZ e BISSET, 2009). Microbiolização de sementes consiste na utilização de microrganismos ou de seus metabólitos, na proteção de sementes, sendo este método já utilizado na promoção de germinação, crescimento de plantas e no controle de diferentes patógenos (LAZZARETTI ALBUQUERQUE e NETO, 2003). e BETTIOL, 1997; LUZ, 2003; FARIA; 34 A utilização de testes in vitro para a seleção de organismos biocontroladores é uma importante ferramenta para a avaliação de um grande número de isolados (LYNCH, 1987; LINHARES; MATSUMURA e LUZ, 1995), e ainda a realização de tratamento de sementes através da microbiolização para avaliar germinação e vigor de plântulas (NGHIEP e GAUR, 2005) surgem como alternativas na busca por medidas de cultivo adequadas. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi selecionar in vitro, isolados de Trichoderma spp. capazes de inibir o crescimento micelial de Rhizoctonia solani Kühn e promover o crescimento de plântulas de arroz. 35 2.2 MATERIAL E MÉTODOS 2.2.1 Isolados de Trichoderma spp. Foram utilizados 13 isolados de Trichoderma spp., dos quais um foi Trichoderma asperellum proveniente da Universidade Federal de Viçosa- Viçosa-MG, Brasil, e os demais, provenientes de solos rizosféricos de espécies florestais em áreas reflorestadas e matas nativas, da Base de Urucu, Coari- AM, pertencentes à unidade da PETROBRÁS. Estes isolados encontram-se armazenados na coleção de microrganismos do Laboratório de Proteção de Plantas da Universidade Federal Rural da Amazônia (Belém-PA, Brasil). Isolamento: Os isolados de Trichoderma foram obtidos através do método de diluição seriada, sendo diluídos 10 g de cada amostra de solo rizosférico em 90 ml de água destilada estéril. A solução de solo obtida foi agitada por 10 minutos à 85 rpm até se tornar uma suspensão homogênea. As diluições foram procedidas nas concentrações 10-1 a 10-6 e em seguidas foram plaqueadas 100µl da suspensão de solo em placas de Petri contendo meio de BDA (BatataDextrose-Ágar) e espalhada com auxílio de alça de Drigalski. As placas foram mantidas a ±25ºC sob luz contínua e após 48 horas foi realizada a contagem das colônias na diluição onde as mesmas encontravam-se isoladas. Os isolados obtidos foram preservados de acordo com o método de Castellane. 2.2.2 Isolado de Rhizoctonia solani Kühn. O isolado de R. solani 4F, foi proveniente da Coleção de Fungos Fitopatogênicos da Embrapa Arroz e Feijão (Goiânia-GO, Brasil). 36 2.2.3 Confrontação direta Para avaliar o antagonismo direto de diferentes isolados de Trichoderma spp. à R. solani utilizou-se o método de pareamento. Em placas de Petri contendo meio de cultura BDA, foram colocados em pontos equidistantes, discos de cultura de R. solani e de cada um dos isolados de Trichoderma spp. avaliados, ambos a 1,0 cm de distância da borda da placa e mantidas sob luz contínua a ± 25°C em câmaras de crescimento. Os tratamentos foram: R. solani (Testemunha); isolado de Trichoderma 06 (T.06); isolado de Trichoderma 07 (T.07); isolado de Trichoderma 09 (T.09); isolado de Trichoderma 12 (T.12); isolado de Trichoderma 13 (T.13); isolado de Trichoderma 20 (T.20); isolado de Trichoderma 21 (T.21); isolado de Trichoderma 34 (T.34); isolado de Trichoderma 42 (T.42); isolado de Trichoderma 46 (T.46); isolado de Trichoderma 47 (T.47); isolado de Trichoderma 52 (T.52) e Trichoderma asperellum (T.a). 2.2.4 Interação de hifas A metodologia empregada foi semelhante ao teste de pareamento, com exceção de que neste, uma lamínula, previamente esterilizada, foi posicionada centralmente, entre as colônias do antagonista e desafiante. As placas foram mantidas a ± 25°C, sob luz contínua até que fosse observado o crescimento de hifas de ambos os fungos, sob a lamínula. Após esse período, as lamínulas foram retiradas, para montagem de lâminas microscópicas e observação sob microscopia óptica e fotografadas em objetiva de 40x. 2.2.5 Produção de compostos tóxicos Em erlenmeyers (125 mL) contendo 75 mL de meio BD (batata-dextrose), adicionouse 10 discos de BDA contendo micélio e esporos dos isolados de Trichoderma spp. Estes 37 foram colocados sob agitação contínua, por três dias a 85 rpm, em condições de escuro. Após este período foi realizada a dupla filtragem do conteúdo em filtro de Millipore 0,45µm. Em placas de Petri contendo meio BDA foram feitos quatro orifícios de 5 mm em pontos eqüidistantes e colocado em cada orifício 1µL do filtrado e centralmente foi depositado um disco de R solani. Na testemunha foi adicionado apenas água nos orifícios. 2.2.6 Produção de compostos voláteis A produção de compostos foi avaliada pela adição de meio BDA em tampas de placas de Petri, onde na extremidade inferior semeou-se um disco de BDA contendo micélio e conídios de Trichoderma spp. e na extremidade superior um disco de micélio de R. solani. As tampas foram posicionadas umas sobre as outras e seladas. No tratamento testemunha, R. solani foi colocada em ambas as tampas das placas. As placas foram mantidas a ± 25 °C, sob luz contínua. 2.2.7 Colonização de raiz de arroz por Trichoderma spp. Sementes de arroz da cultivar „BRS Jaburu‟ foram tratadas com quatro isolados de Trichoderma spp., T.06, T.09, T.12 e T.52 via pó, considerados os mais promissores de acordo com os testes in vitro dos ensaios 3.3.3 à 3.3.6 e semeadas em caixa tipo gerbox contendo papel de filtro estéril, umedecido com água destilada e estéril. Aos seis dias após o tratamento avaliou-se a germinação das sementes e, posteriormente foram realizadas visualizações diárias, sob microscópio estereoscópico, para observar a provável colonização de Trichoderma spp. sobre as raízes das plântulas. A testemunha constou de sementes tratadas com água. Para obtenção do pó de Trichoderma, foram semeados discos de BDA com conídios do fungo, em erlenmeyers contendo 100 g de arroz, previamente cozido por cinco minutos e autoclavado a 120 °C, durante 20 minutos, sendo mantidos a ±25°C, sob luz contínua. Após sete dias o arroz colonizado por Trichoderma foi triturado em liquidificador até obtenção do 38 pó. As sementes foram umedecidas e tratadas com dose de 5 g.Kg-1 de semente (ETHUR, 2006). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições e cinco tratamentos (quatro isolados de Trichoderma e um tratamento testemunha). Cada repetição foi composta por uma caixa tipo gerbox, contendo 10 sementes. 2.2.8 Efeito de Trichoderma spp. na germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de arroz Sementes da cultivar “BRS Jaburu” foram tratadas por dois métodos de veiculação, tratamento de semente com Trichoderma via pó (VP) e suspensão de conídios (SP) com isolados de Trichoderma (T.12 T.47, T.52 e T.a-Trichoderma asperellum) previamente selecionados. Os tratamentos foram: Sementes imersas (testemunha - sementes submersas em água por 24h); Sementes umedecidas (testemunha - sementes umedecidas em água por 24 h); T.12 “via suspensão”; T.12 “via pó”; T.47 “via suspensão”; T.47 “via pó”; T.52 “via suspensão”; T.52 “via pó”; T.a “via suspensão” e T.a “via pó”. Trichoderma via suspensão, foi obtido de culturas do fungo cultivado em meio BDA, a ±25º C, sob luz constante por cinco dias, e a concentração ajustada para 6x10 8 conídios. mL-1. As sementes tratadas foram mantidas por 24 horas em suspensão de conídios. A obtenção de Trichoderma via pó e o tratamento de sementes foi igual ao descrito no item 3.3.7. Após 24 horas, as sementes embebidas em suspensão e as tratadas com o pó foram semeadas em caixa tipo gerbox contendo duas folhas de papel de filtro umedecidos com água destilada estéril, sendo 25 sementes de arroz por gerbox. Diariamente o papel de filtro foi umedecido com água destilada e esterilizada. Após 48 horas foi avaliado o número de sementes germinadas e não germinadas e, após 10 dias avaliou-se o número de sementes com germinação normal, germinação anormal, número de sementes mortas e fez-se a medição do comprimento da radícula e do hipocótilo. Foram consideradas como germinação anormal todas as plântulas que apresentaram deficiências do tipo hipocótilo apodrecido, danificado, sem hipocótilo ou sem raiz primária (NAKAGAWA, 1999). O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com quatro repetições e 10 tratamentos em arranjo fatorial 4 x 2 + 2 (quatro isolados de Trichoderma, dois métodos de 39 veiculação, e duas testemunhas). Cada repetição foi composta por uma caixa tipo gerbox contendo 50 sementes. Os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Scott-Knott, ao nível de 5% de probabilidade. 2.2.9 Análise estatística Nos ensaios 2.2.3 à 2.2.6 as avaliações foram feitas após 72 horas da instalação do experimento, medindo-se o diâmetro das colônias em centímetro. E o delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com três repetições e 14 tratamentos (13 isolados de Trichoderma spp. e uma testemunha). A análise de variância foi realizada para todas as variáveis obtidas e as médias dos tratamentos foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade (Sisvar, versão 5.2). 2.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 2.3.1 Confrontação direta Todos os isolados de Trichoderma spp. testados diferiram significativamente da testemunha, com destaque ao T.06 que reduziu o cescimento de R. solani a 1,97 cm, enquanto o patógeno sem presença de isolado de Trichoderma apresentou crescimento de 8,0 cm (Figura 1). Sendo a redução do crescimento micelial de R. solani do isolado T.06 de 75,4%, seguido dos isolados T.13, T.52, T.34 e T.09, que reduziram em 64,1%; 63,7%; 62,9% e 62,5%, respectivamente, o diâmetro da colônia de R. solani. Quando o patógeno foi desafiado pelo isolado T.a ocorreu menor redução do crescimento micelial do fitopatógeno, em torno de 4,0 cm, enquanto a testemunha apresentou crescimento de 8 cm (Figura 1), equivalendo a 49% de redução. 40 Figura 1: Diâmetro da colônia de Rhizoctonia solani em confrontação direta com diferentes isolados de Trichoderma spp. Os tratamentos foram: R. solani (Testemunha); isolado de Trichoderma 06 (T.06); isolado de Trichoderma 07 (T.07); isolado de Trichoderma 12 (T.12); isolado de Trichoderma 13 (T.13); isolado de Trichoderma 20 (T.20); isolado de Trichoderma 21 (T.21); isolado de Trichoderma 34 (T.34); isolado de Trichoderma 42 (T.42); isolado de Trichoderma 46 (T.46); isolado de Trichoderma 47 (T.47); isolado de Trichoderma 52 (T.52); isolado de Trichoderma 09 (T.09) e Trichoderma asperellum (T.a). Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 1% de probabilidade. Estas alterações evidenciam o parasitismo e a competição por espaço e nutrientes (PAPAVIZAS, 1985), entretanto mais de um mecanismo de ação pode está concomitantemente envolvido na ação antagonista de Trichoderma, como competição, considerado um dos mais eficientes mecanismos, podendo resultar ao patógeno, limitação de nutrientes, água, ou sítios onde esses fatores nutricionais são mais abundantes (PERELLO et al., 2003). Em trabalho realizado por Melo e Faull (2000) Trichoderma apresentou de 79 a 82% de inibição de crescimento de R. solani proveniente de arroz. Resultado semelhante foi encontrado em trabalho realizado por Bonfim (2007), onde todos os isolados de Trichoderma spp. testados apresentaram rápido crescimento micelial diferindo estatisticamente da testemunha ao inibir o desenvolvimento de Rhizopus stolonifer de maracujazeiro. Carvalho Filho et al. (2008), demonstraram o potencial dos isolados de Trichoderma spp. em controlar Cylidrocladium. 41 2.3.2 Interação de hifas. Foi observado que dos 13 isolados avaliados, seis destes (T.06, T.07, T.09, T.12, T.21, T.52 e T.a) promoveram o enrolamento, crescimento paralelo e/ou estrangulamento das hifas de R. solani (Figura 2), indicando o potencial dos isolados de Trichoderma estudados no controle do patógeno através desse mecanismo de ação. a b c d e f g Figura 2: Interação de hifas entre isolados de Trichoderma spp. e R.solani. Isolados: T.06 (a); T.07 (b); T.09 (c); T.12 (d); T.21(e); T.52 (f) e T.a (g). Este enrolamento e estrangulamento pode causar a destruição da parede celular, provavelmente para obter nutrientes a partir das células mortas (MELO, 1998). Enzimas produzidas por Trichoderma spp. como quitinases e celulases, lisam ou degradam a parede celular do patógeno (ELAD; CHET e HENIS, 1982). Essas enzimas hidrolizam a parede 42 celular de outros fungos, sendo induzidas por diferentes polímeros componentes da parede dos fungos alvo (HOWELL, 2005). Melo e Faull (2000) ao estudarem o parasitismo de R. solani por isolados de Trichoderma, também afirmam que enzimas líticas parecem ser capazes de degradar a parede celular de R. solani . 2.3.3 Produção de compostos tóxicos Nenhum dos 13 isolados de Trichoderma spp. avaliados proporcionaram redução do crescimento micelial de R. solani por produção de compostos tóxicos. Em resultados contrários, Trichoderma inibiu o crescimento de patógenos por mecanismos como a produção de antibióticos ativos (SMITH; WILCOX e HARMAN, 1990; CHAMBERS e SCOTT, 1995). Segundo Ethur; Cembranel e Silva (2001) a eficiência de metabólitos tóxicos produzidos por espécies de Trichoderma spp. foi evidenciada em trabalhos, como de Reis; Oliveira e Menezes (1995) e, Aparecido; Egydio e Figueiredo (1999) demonstrando haver difusão desses metabólitos sobre hifas de muitos outros patógenos. E ainda que fungos do gênero Trichoderma se demonstrem com tais eficiências, os isolados testados neste ensaio não foram promissores no controle de R. solani. 2.3.4 Produção de compostos voláteis Os isolados T.52, T.12, T.09 e T.a diferiram significativamente da testemunha quanto a redução do crescimento micelial de R. solani pela produção de compostos voláteis, onde as colônias do fitopatógeno atingiram crescimento, respectivamente de, 1,4 cm, 5,17 cm, 5,45 e 5,63, enquanto a testemunha apresentou crescimento de 8.0 cm (Figura 3). A percentagem de inibição do crescimento micelial de R. solani pelos isolados T.52, T.12, T.09 e T.a, foi respectivamente: 82,5%, 35,4%, 31,9% e 29,6%. 43 Diâmetro da colônia (cm) 9 c 8 c c c c c c c c c 7 6 b 5 b b 4 3 2 a 1 0 Isolados Figura 3. Produção de compostos voláteis de diferentes isolados de Trichoderma spp em relação ao crescimento micelial de Rhizoctonia solani. Os tratamentos foram: R. solani (Testemunha); isolado de Trichoderma 06 (T.06); isolado de Trichoderma 07 (T.07); isolado de Trichoderma 12 (T.12); isolado de Trichoderma 13 (T.13); isolado de Trichoderma 20 (T.20); isolado de Trichoderma 21 (T.21); isolado de Trichoderma 34 (T.34); isolado de Trichoderma 42 (T.42); isolado de Trichoderma 46 (T.46); isolado de Trichoderma 47 (T.47); isolado de Trichoderma 52 (T.52); isolado de Trichoderma 09 (T.09) e Trichoderma asperellum (T.a). Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 1% de probabilidade. Os isolados do gênero Trichoderma são capazes de produzir metabólitos voláteis com efeito inibitório sobre o crescimento micelial de vários fungos (DENNIS e WEBSTER, 1971a, 1971b, 1971c). Entre tais metabólitos, há gases, como: etileno e cianeto de hidrogênio (CAMPBELL, 1989), acetaldeído, acetona, etanol e dióxido de carbono (TAMIMI e HUTCHINSON, 1975), que afetam o crescimento microbiano. Esses gases são ativos em baixas concentrações, mas não são considerados como antibióticos. De acordo com Mangenot e Diem (1979), o CO2 é uma das substâncias voláteis produzidas por antagonistas mais estudadas e seus efeitos em fungos são bastante variáveis, podendo ser estimulantes ou inibitórias, o mesmo ocorrendo com a amônia, enquanto o etileno não é inibitório, porém facilita a formação de derivados inibidores, como o alil-álcool. O potencial de metabólitos voláteis ocorre devido a maior facilidade de difusão no ambiente solo, por meio de poros ou filmes d‟água, conseguindo muitas vezes atingir de maneira eficiente patógenos deste ambiente, como R. solani (LOBO JÚNIOR e ABREU, 2000). Os resultados do presente trabalho demonstraram-se satisfatórios, porém torna-se necessário a confirmação da eficiência dos isolados em ensaios em casa de vegetação. 44 2.3.5 Colonização de raiz de arroz por Trichoderma spp Todos os isolados de Trichoderma formulado em pó, foram capazes de crescer sobre a radícula e região do hipocótilo das plântulas (Figura 4). a a a b b b c c c d d d Figura 4. Microbiolização de sementes de arroz tratadas com quatro isolados de Trichoderma (a): T.06; (b): T.09; (c): T.12; (d): T.52. Estes resultados podem ser considerados positivos para a utilização destes isolados de Trichoderma, uma vez que, ao colonizar o sistema radicular da planta, pode inibir a colonização por fitopatógenos, formando uma barreira em torno da raiz, além de promover o crescimento da plântula. 45 O tratamento de sementes com microrganismos antagonistas pode promover bom desenvolvimento de plantas de forma geral, incluindo os efeitos benéficos na germinação de sementes, emergência e desenvolvimento das plântulas, uma vez que, fungos do gênero Trichoderma são capazes de atuar como bioestimulante do crescimento radicular, promovendo o desenvolvimento de raízes através de fitohormônios, e assim melhorar a assimilação de nutrientes o que aumenta a resistência diante de fatores bióticos não favoráveis, além de degradar fontes de nutrientes que serão de fundamental importância para o desenvolvimento do vegetal (HARMAN, 2000; HARMAN et al., 2004). Introduzir microrganismos em sementes a fim de reduzir a transmissão de patógenos, tem sido uma alternativa explorada com sucesso. Fessehaie e Walcott (2005) ao tratarem sementes de melancia com isolado avirulento de Acidovorax avenae subsp. avenae ou de Pseudomonas fluorescens, obtiveram redução da transmissão via semente para plântulas da bactéria patogênica A. avenae subsp. citruli . 2.3.6 Efeito de Trichoderma spp. na germinação de sementes e desenvolvimento de plântulas de arroz A porcentagem de sementes germinadas após 48 horas do semeio, não diferiru significativamente entre os tratamentos com Trichoderma e a testemunha. A germinação variou de 77,5 a 85,5 % (Tabela 1). Demonstrando que nenhum dos isolados testados afetaram negativamente a germinação das sementes de arroz. 46 Tabela 1: Germinação de sementes (%) de arroz tratadas com Trichoderma spp. formulados em pó e suspensão de conídios [6 x108. esporos.mL-1]. Tratamento Germinação (%) T.a (VP) 77,50 a T.52 (VP) 77,50 a T.12 (SP) 79,00 a T.52 (SP) 80,00 a Testemunha (submersas em água por 24 h) 81,00 a T.12 (VP) 81,50 a T.a (SP) 81,50 a Testemunha (umedecidas em água) 81,50 a T.47 (SP) 82,50 a T.47 (VP) 85,50 a VP: Trichoderma via pó; SP: Trichoderma via suspensão. Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. A porcentagem de germinação normal foi maior do que a germinação anormal e sementes mortas (Figura 5). E ainda que não tenha ocorrido diferença estatística entre os tratamentos, as sementes tratadas com isolados de Trichoderma, com exceção do isolado T.47 apresentaram menores índices de germinação quando comparado com a testemunha. Um dos problemas que podem ser ocasionados ao tratar sementes com agentes de biocontrole, é que, estes podem muitas das vezes serem deletérios às sementes, afetando sua germinação (LUCON, 2009). Porém os isolados avaliados não apresentaram nenhum dano à semente quando comparado a testemunha, podendo portanto ser viabilizado o uso dos mesmos no tratamento de sementes de arroz. Para a germinação normal (Figura 5-a) os tratamentos não diferiram significativamente entre si, porém os tratamentos com os isolados T.12, T.47 e T.52 via pó e suspensão apresentaram tendência em proporcionar melhores índices de germinação normal quando comparado com os tratamentos testemunha. Em trabalho realizado por Ethur (2006), ao estudar a germinação de sementes de tomate, os resultados foram contrários, uma vez que, ocorreu diferença estatística entre os tratamentos, porém neste ensaio, os isolados de Trichoderma avaliados proporcionaram menor número de sementes com germinação normal, (36,5%) quando comparado com a testemunha (80,5%), sendo mais eficiente realizar o tratamento apenas com sementes umedecidas em água. 47 Em relação à germinação anormal observou-se que apenas os tratamentos T.12 pó, T.47 suspensão e T.52 via pó e suspensão, diferiram das testemunhas (Figura 5-b), apresentando menor número de sementes com essa característica, evidenciando o potencial em promover satisfatória germinação de sementes, e consequentemente bom crescimento e vigor de plântulas evitando a morte das mesmas (NGHIEP e GAUR, 2005). Na avaliação do número de sementes mortas todos os isolados de Trichoderma testados não diferiram do tratamento testemunha (Figura 5-c), porém vale ressaltar que, os tratamentos T.12 suspensão e T.47 pó apresentaram menores sinais de danos ou apodrecimento às sementes. Trichoderma spp. pode atuar como apodrecedor de sementes de tomate, se as mesmas estiverem em contato com o agente de biocontrole e o ambiente apresentar umidade, propiciando o rápido desenvolvimento sobre o envoltório das sementes (ETHUR, 2006). Há espécies fúngicas de Trichoderma capazes de reduzir a germinação das sementes, produzirem plantas jovens raquíticas e necroses em hipocótilo e raízes (CHAMBERLAIN e GRAY, 1974). 48 40 Germinação normal (%) 35 a 30 a a a a a a a a a a a a a b 25 20 15 10 5 0 Germinação anormal (%) Isolados de Trichoderma spp. 12 10 a 8 6 4 b b b a a b 2 0 Isolados de Trichoderma spp. Sementes mortas (%) 12 10 a a a a a a a a c 8 6 a a 4 2 0 Isolados de Trichoderma spp. Figura 5: Germinação de sementes (%) de arroz tratadas com isolados de Trichoderma spp.: Germinação normal (a); Germinação anormal (b); Sementes mortas (c). Os tratamentos foram: Sementes imersas (testemunha - sementes submersas em água por 24h); Sementes umedecidas (testemunha - sementes umedecidas em água por 24 h); T.12 “Susp.”; T.12 “Pó”; T.47 “Susp.”; T.47 “Pó”; T.52 “Susp.”; T.52 “Pó”; T.a “Susp.” e T.a “Pó” (“Susp”: sementes tratadas em Trichoderma via suspensão por 24 h / “Pó”: sementes tratadas em Trichoderma via pó por 24 h). Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey a ao nível de 5% de probabilidade. 49 O tratamento com o isolado T.a via suspensão e sementes imersas obtiveram maiores médias de comprimento do hipocótilo, diferindo significativamente de todos os outros Comprimento do hipocótilo (mm) tratamentos (Figura 6.a). 25 a 20 15 10 c c c b b b b b a a 5 0 Comprimento da radícula (mm) T.12 pó T.52 pó Test. Sem. T.12 susp. T.47 susp. T.47 pó T.52 susp. umedecidas Isolados de Trichoderma spp. 25 a 20 b 15 10 b b a a T.47 pó T.12 pó T.a susp T.a pó Test. Sem. imersas T.a susp. a a a T.52 pó Test. Sem. umedecidas b c 5 0 T.a pó T.12 susp T.52 susp T.47 susp Test. Sem. imersas Isolados de Trichoderma spp. Figura 6: Crescimento do hipócotilo (mm) (a) e radicula (mm) (b) em sementes tratadas com Trichoderma spp. Os tratamentos foram: Sementes imersas (testemunha - sementes submersas em água por 24h); Sementes umedecidas (testemunha - sementes umedecidas em água por 24 h); T.12 “Susp.”; T.12 “Pó”; T.47 “Susp.”; T.47 “Pó”; T.52 “Susp.”; T.52 “Pó”; T.a “Susp.” e T.a “Pó” (“Susp”: sementes tratadas em Trichoderma via suspensão por 24 h / “Pó”: sementes tratadas em Trichoderma via pó por 24 h). Médias seguidas por mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. A promoção no crescimento da plântula pode estar relacionada com a produção de hormônios, pela disponibilidade de nutrientes do solo ou matéria orgânica e aumento na captação ou translocação de minerais (KLEIFELD e CHET, 1992). No presente trabalho, o aumento do hipocótilo provavelmente está mais relacionado à produção de biomoléculas análogas à fitohormonios as quais podem desencadear alterações na rota do metabolismo do 50 crescimento de plântulas já que o ensaio foi realizado sobre papel de filtro em caixa tipo gerbox. Em trabalho com pepineiros constatou-se que o estímulo do crescimento realizado por isolado de T. harzianum em meio hidropônico, estava na interação formada entre fungo e planta (YEDIDIA; BENHAMOU e CHET, 1999; ETHUR, 2006) Ao avaliar o comprimento da radícula, sementes tratadas com os isolados T.47 e T.a via suspensão, T.52 e T.12 via pó, não diferiram estatisticamente dos tratamentos testemunhas (Figura 6.b), apresentando satisfatório desenvolvimento radicular, uma vez que, apesar de não ter ocorrido estímulo no desenvolvimento radicular, não proporcionou efeito contrário, como ocorreu com todos os outros tratamentos testados. Da mesma forma, em trabalho realizado por Ethur (2006), buscando avaliar desenvolvimento de plântulas de pepineiro, isolados de Trichoderma spp. (ETSR20 e mix) inibiram a germinação e o desenvolvimento não apenas da radícula, mas também do hipocótilo. O desenvolvimento da radícula foi superior ao desenvolvimento do hipocótilo, em todos os tratamentos, demonstrando provável maior indução radicular. Tal desenvolvimento pode ser justificado pela influência do Trichoderma spp. através da produção de reguladores de crescimento como os jasmonatos, que regulam germinação de sementes e crescimento radicular (BAKER e COOK, 1974). 51 2.4 CONCLUSÕES  Todos os isolados reduziram o crescimento micelial de Rhizoctonia solani in vitro, com destaque aos isolados T.06, T.09, T.12, T.52 e T. asperellum.  Todos os isolados de Trichoderma spp. não afetaram negativamente a germinação de sementes de arroz.  T. asperellum via suspensão proporcionou maior desenvolvimento do hipocótilo;  Os isolados de Trichoderma T.12, T.a e T.52 via pó, assim como, os isolados T.47 e T.a via suspensão, não afetam o desenvolvimento radicular de plântulas de arroz. 52 REFERÊNCIAS APARECIDO, C.C.; EGYDIO, A.P.M.; FIGUEIREDO, M.B. Eficiência do método de Castellani (água destilada) para a preservação de fungos fitopatogênicos. In: REUNIÃO CIENTÍFICA EM CIÊNCIAS AGRÁRIAS DO LAGEADO, Botucatu, SP, 1999. Resumos.... 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Comparados às testemunhas, os isolados T.06, T.09 e T.52 promoveram o incremento do comprimento da parte aérea em torno de 8,1%. Não houve promoção no comprimento de raiz por nenhum dos isolados de Trichoderma testados. O T.12 proporcionou aumento de 61,2% e de 32,9% na massa seca de parte aérea e raiz, respectivamente. O tratamento do substrato e de sementes, independente do método de veiculação, com os isolados do Trichoderma reduziram a severidade da queima-da-bainha em 50,1% pelo T.06 via suspensão. Os resultados sugerem que o uso desse agente de biocontrole no tratamento de semente combinado às aplicações preventivas podem reduzir a severidade da queima-da bainha e promover o crescimento de plantas de arroz. Palavras-chave: Oryza sativa L., Rhizoctonia solani, controle biológico, manejo integrado de doenças, promoção do crescimento. 58 CHAPTER 3 CONTROL OF THE SHEATH BLIGHT AND GROWTH OF RICE PLANTS BY Trichoderma spp. ISOLATES. ABSTRACT: On the present study the effect of four Trichoderma (T.06, T.09, T.12, T.52) isolates important member of microflora, rhizosphere and biological control agent of plants diseases, were evaluated on the phatosystem sheath blight (Rhizoctonia solani) on rice as different ways of serving and application times about the severity of diseases and the promotion of rice growth. The severity and ASCPD of sheath blight were reduced significantly by the Trichoderma isolates when pulverized preventively. The isolate T.09 pulverized five days before the inoculation reduced over 65,5% the severity of the disease. Compared to the spectator the isolates T.06, T.09 and T.52 promoted the length increment of the aerial part in over 8,1%. There was no length rise by nay of the Trichoderma isolates tested. The T.12 provided a rise of 61,2% and 32,9% on the dry mass of the aerial part and root respectively. The treatment of the substratum and of seeds regardless of method of transmission with the Trichoderma isolates reduced the severity of sheath blight in 50,1% by the T.06 by way of suspension. The results suggest that the use of this biological agent on the treatment of seed combined to the preventive applications may reduce the severity of sheath blight and promote the rice plants growth. Keywords: Oryza sativa L., Rhizoctonia solani, biological control, integrated management of diseases, growth promotion. 59 3.1 INTRODUÇÃO O arroz é produto de importância econômica em muitos países em desenvolvimento, e o aumento crescente de seu consumo impõe aos setores produtivos a busca de novas técnicas de cultivo (WANDER, 2006) que possam assegurar a produtividade das cultivares melhoradas, visto que apresentam suscetibilidade a doenças que causam danos durante o desenvolvimento da cultura no campo. Dentre essas, destaca-se a queima da bainha, causada por Rhizoctonia solani Kühn, fungo habitante do solo e responsável por severos danos econômicos à cultura do arroz (PRABHU et al., 2002; ARAÚJO e ARAÚJO, 2006). A queima da bainha inicia-se por sementes contaminadas e quando os escleródios, disseminados pela água atingem as bainhas e folhas das plantas germinam sobre a superfície alcançando rapidamente o interior dos tecidos, levando ao aparecimento de manchas de coloração verde-acinzentadas que evoluem para marrons e sem bordas definidas, sobre as quais podem desenvolver novas hifas e escleródios (RIBEIRO e TANAKA, 1984; BEDENDO e PRABHU, 2005; EMBRAPA ARROZ E FEIJÃO, 2006). A capacidade de formar escleródios associado ao amplo espectro de hospedeiros resulta no difícil controle de R. solani (WEBSTER e GUNELL, 1992). O manejo da queima-da-bainha é principalmente realizado pelo controle químico, entretanto existem poucos produtos registrados e os resultados ao longo das safras não tem sido satisfatórios. A melhor relação custo-benefício e ambientalmente econômica e segura para controle das doenças é o uso de cultivares resistentes (AKKOPRU e DEMIR, 2005), porém as cultivares de arroz irrigado tradicionais e com elevado potencial produtivo apresentam-se suscetíveis à queima da bainha. A dificuldade do manejo da queima da bainha e os enfoques com a proteção ambiental têm estimulado as pesquisas com controle biológico (FRAVEL; DEAHL e STOMME, 2005). Entre os agentes de biocontrole utilizados para controle de R. solani tem-se o fungo do gênero Trichoderma (SOUZA e DUTRA, 2003). Este agente de biocontrole é um importante membro da rizosfera, sendo considerado efetivo na proteção de plantas contra fitopatógenos, na promoção do crescimento e no aumento da tolerância da planta a vários estresses abióticos (CHANG et al., 1986; GRAVEL; ANTOUN e TWENDDELL, 2007; SOUZA et al., 2004). A redução da severidade da doença por Trichoderma pode ocorrer por diferentes mecanismos, competição, antibiose, indução de resistência e sua efetividade é dependente do patossistema, 60 do isolado, da composição da rizosfera, da forma de aplicação e das condições ambientais (MELO, 1998). A promoção do crescimento já foi registrado em culturas como berinjela, feijão, milho, algodão, plantas ornamentais e pimentão (YEDIDIA; BENHAMOU e CHET, 1999; HARMAN et al., 2004; RESENDE et al., 2004; GRAVEL; ANTOUN e TWENDDELL, 2007). Os benefícios para a planta na presença de Trichoderma sugerem como uma interação com um simbionte avirulento (HARMAN et al., 2004; YEDIDIA; BENHAMOU e CHET, 1999). Resultados obtidos com feijão mostram que o incremento na promoção do crescimento e a indução de resistência ao patógeno são relacionados à composição da rizosfera e a capacidade endofítica dos isolados, sendo essas características relacionadas aos isolados e não com a espécie de Trichoderma utilizada (HOYOS-CARVAJAL; ORDUZ e BISSET, 2009). Linhagens de Trichoderma viride e T. harzianum foram considerados eficazes no controle de R. solani do arroz (KRISHNAMURTHY et al., 1999). O estudo do uso de Trichoderma no controle da queima da bainha em arroz tem sido realizado em várias regiões do Brasil e do mundo. Entretanto, nas regiões de clima tropical, com elevada temperatura e umidade, ocorre alterações na atividade e na composição microbiana na rizosfera, requerendo a seleção de isolados desse fungo no bioma amazônico. A obtenção de isolados de Trichoderma spp. adaptados a essas condições com cultivares de arroz produtivas constituem em uma alternativa para o manejo da queima-da-bainha além da promoção do crescimento do arroz. Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar isolados de Trichoderma spp. provenientes da região amazônica capazes de reduzir a severidade da queima-da-bainha e promover o crescimento do arroz por diferentes métodos de aplicação, em condições de casade-vegetação. 61 3.2 MATERIAL E MÉTODOS Obtenção de inóculo de Rhizoctonia solani O inóculo de R solani, 4F (proveniente da Coleção de Fungos Fitopatogênicos da Embrapa Arroz e Feijão/Goiânia-GO, Brasil), foi obtido através de cultivo em casca (C) e grãos de arroz (GA), na proporção de 3:1 (meio CGA), respectivamente. Os grãos de arroz parboilizado foram previamente cozidos por cinco minutos, a mistura foi colocada em erlenmeyers, e autoclavada por 20 minutos a 120 °C atm. Ao meio CGA adicionou-se 15 discos de micélio de R. solani, crescido em BDA, por sete dias e incubados a ±25 ºC em regime de luz contínua (PRABHU et al., 2002). Obtenção de isolados de Trichoderma spp. Os isolados foram obtidos de solos rizosféricos de espécies florestais em áreas reflorestadas e matas nativas (Base de Urucu/Coari- AM) da floresta amazônica, através do método de diluição seriada, onde 10 g de cada amostra de solo rizosférico coletado foi diluído em 90 ml de água destilada e estéril. Esta solução foi agitada por 10 minutos a 85 rpm até se tornar uma suspensão homogênea. As diluições foram procedidas nas concentrações de 10-1 a 10-6 e em seguidas foram plaqueadas 100µl da suspensão de solo em placas de Petri contendo meio de BDA (Batata-Dextrose-Ágar) e espalhada com auxílio de alça de Drigalski. As placas foram mantidas a ±25ºC e após 48 horas foi realizada a contagem das colônias na diluição onde as mesmas encontravam-se isoladas. Os isolados obtidos foram preservados de acordo com o método de Castellani. Após os testes in vitro, foram selecionados quatro isolados, T.06, T.09, T.12 e T.52, sendo veiculados via pó e suspensão de conídios. Discos de BDA contendo micélio e conídios dos isolados de Trichoderma, foram semeados em erlenmeyers contendo 100 g de arroz, previamente cozido por cinco minutos e autoclavado a 120 °C, durante 20 minutos, sendo mantidos a ±25°C, sob luz contínua. Após sete dias o arroz colonizado por Trichoderma foi triturado em liquidificador até obtenção do pó. As sementes foram umedecidas e tratadas com dose de 5 g.Kg-1 de sementes (ETHUR, 2006). 62 Trichoderma via suspensão foi obtido de culturas do fungo cultivado em meio BDA, a ±25º C, sob luz constante por cinco dias, e a concentração da suspensão ajustada para 6x108 conídios. mL-1. As sementes tratadas foram mantidas submersas por 24 horas em suspensão de conídios. Foram utilizadas sementes da cultivar “BRS Jaburu”, previamente desinfestadas em álcool a 70% e hipoclorito (2%), e lavadas em água corrente. 3.2.1 Efeito da pulverização preventiva e curativa de isolados de Trichoderma spp. sobre a queima-da-bainha do arroz Sementes da cultivar BRS Jaburu, foram semeadas em bandejas contendo substrato Plantmax®, e após 14 dias fez-se o transplantio mantendo três plantas por vaso, contendo dois quilos do substrato, adubado com cinco gramas de NPK. Os isolados de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52) foram aplicados em quatro períodos, P1: pulverização de Trichoderma cinco dias antes da inoculação de R. solani; P2: pulverização de Trichoderma simultâneo à inoculação de R. solani; P3: pulverização de Trichoderma seis dias após à inoculação de R. solani; P4: pulverização de Trichoderma 12 dias após a inoculação de R. solani. As plantas testemunhas foram pulverizadas com água e inoculadas com o patógeno. As pulverizações foram feitas sobre as folhas, até o ponto de escorrimento da suspensão. O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso, em arranjo fatorial 4 x 4 + 1 (4 isolados de Trichoderma, 4 períodos de aplicação + 1 testemunha), com quatro repetições, cada uma composta por um vaso contendo três plantas. A inoculação com R. solani foi feita nas plantas de arroz aos 49 dias de idade, adicionando-se dois discos de micélio por planta e 1g de CGA por vaso ao redor da bainha de cada planta. As plantas foram incubadas por 48 horas, sob temperatura entre 25º e 30º C e umidade acima de 90%. Após esse período as plantas foram mantidas em temperatura e umidade ambiente. A severidade da doença foi avaliada com base no comprimento da lesão do perfilho principal de cada repetição, sendo feitas cinco avaliações, em intervalos que variaram de quatro a 11 dias, sendo calculada a Área Sob a Curva de Progresso da Doença (ASCPD) considerando as cinco avaliações da severidade da doença (SHANNER e FINNEY, 1977). 63 3.2.2 Avaliação do tratamento de sementes combinado a pulverização curativa de Trichoderma spp. no controle da queima-da-bainha do arroz. O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado, e os tratamentos em esquema fatorial 4 x 3 + 1 (4 isolados, 3 épocas de pulverização + 1 testemunha), com quatro repetições, e cada repetição foi representada por um vaso contendo três plantas). Os tratamentos foram constituídos de quatro isolados de Trichoderma (T.06, T.09, T.12 e T.52) e três diferentes épocas de pulverização: E1: Pulverização de Trichoderma spp. sete dias após a inoculação de R. solani; E2: Pulverização de Trichoderma spp. onze dias após a inoculação de R. solani; E3: Pulverização de Trichoderma spp. quinze dias após à inoculação de R. solani. No tratamento testemunha as sementes não foram tratadas, sendo as plantas pulverizadas com água e inoculadas com o patógeno. As sementes dos tratamentos E1, E2 e E3 foram tratadas com Trichoderma via pó (5 g.Kg-1 de semente), semeando cinco sementes por vaso, e após 14 dias fez-se o desbaste, mantendo três plantas por vaso. Foi inoculada R. solani em plantas de arroz aos 38 dias de idade, adicionando-se um disco de micélio por planta e 5g de CGA por vaso ao redor da bainha de cada planta. As plantas foram incubadas por 48 horas e após esse período as plantas foram mantidas em temperatura e umidade ambiente. Os sintomas foram visualizados quatro dias após a inoculação. Fez-se quatro avaliações em intervalos que variaram de quatro a cinco dias para dados de severidade e análise da ASCPD. 3.2.3 Efeito do tratamento de sementes combinado a pulverização curativa de Trichoderma spp. na promoção do crescimento de plantas de arroz Para avaliar o potencial de promoção de crescimento dos quatro isolados de Trichoderma spp. estudados, fez-se o tratamento de sementes e em plantas com 45 dias os isolados foram pulverizados uma única vez, sendo as plantas testemunha pulverizadas apenas com água. O experimento foi inteiramente casualizado com quatro tratamentos, sendo quatro isolados de Trichoderma spp., quatro repetições por tratamento e uma testemunha, e cada repetição composta por um vaso contendo três plantas. Fez-se a avaliação do comprimento e massa seca de raiz e parte aérea das plantas aos 90 dias de idade. 64 A biomassa (comprimento da parte aérea e da raiz e massa seca da parte aérea e raiz) foi determinada acondicionando-se as plantas em sacos de papel e colocadas em estufa por 72 horas a 70°C. 3.2.4 Efeito de Trichoderma spp. aplicado via tratamento de semente e substrato contra Rhizoctonia solani em arroz O ensaio foi realizado em delineamento inteiramente casualizado, em arranjo fatorial 4 x 3 + 1 (4 isolados de Trichoderma, 3 métodos de veiculação de Trichoderma e + 1 testemunha) com 4 repetições, sendo cada uma representada por um vaso contendo três plantas. Os tratamentos foram constituídos de quatro isolados de Trichoderma (T.06, T.09, T.12 e T.52) e três diferentes métodos de veiculação: M1: sementes tratadas com Trichoderma via pó; M2: sementes tratadas com Trichoderma via suspensão; M3: adição de Trichoderma via pó no substrato (5 g / 2 kg de substrato); e a testemunha inoculada com R. solani. Fez-se o semeio, mantendo três plantas por vaso e aos 45 dias de idade foi inoculado R. solani, sendo adicionando 5g de CGA por vaso ao redor da bainha de cada planta, mantendo-se câmara úmida. A análise de severidade e ASCPD da doença foi obtida através de cinco avaliações de comprimento das lesões, em intervalos que variaram de quatro a cinco dias. 3.2.5 Análise Estatística A análise de variância foi feita para todas as variáveis e as médias dos tratamentos comparados pelo teste de Scott-Knott ao nível de 1 e 5% de probabilidade, empregando o programa Sisvar versão 5.2. 65 3.3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.3.1 Efeito da pulverização preventiva e curativa de isolados de Trichoderma spp. sobre a queima-da-bainha do arroz A severidade da queima-da-bainha em arroz em relação a todos os isolados de Trichoderma, independente do período de aplicação testado diferiram significativamente da testemunha. O isolado T.09 pulverizado cinco dias antes da inoculação, apresentou menor severidade da doença, com altura média da lesão de 4,88 cm, enquanto que a testemunha apresentou média de 13,75 cm (Figura 7), sendo a eficiência de controle da doença de 65,5% em relação à testemunha. Considerando as duas variáveis, severidade e ASCPD, o isolado T.09 foi superior na redução da queima-da-bainha em arroz. A ASCPD foi menor quando os isolados de Trichoderma foram aplicados de maneira preventiva, simultânea e após a inoculação com R. solani quando comparado a testemunha (Figura 8). Os isolados T.06 e T.09 não diferiram significativamente quando aplicados preventivo e simultaneamente, enquanto que os isolados T.12 e T.52 proporcionaram menor ASCPD quando aplicados preventivamente do que, quando aplicados simultâneo e após aparecimento da doença. A eficiência relativa do isolado T.09 foi igual a 64,51%. De modo geral os melhores resultados com agente de controle biológico (ACB) ocorrem quando aplicados preventivamente, isso pode ser devido à elevada capacidade de adaptação de Trichoderma em competir com outros microrganismos por espaço, colonizando mais rapidamente a estrutura do solo e melhor se adaptando as condições deste. A chave para o sucesso do controle biológico no campo tem sido compreendido pela dinâmica das interações entre o agente de controle biológico (ACB), patógeno do solo e a rizosfera (PAULITZ, 2000). A maioria dos ACBs são aplicados em estratégias inundativas como pulverização, isto é importante para manter elevada a população dos ACBs por longos períodos e assim obter o efeito sobre o patógeno. No presente estudo o patógeno R. solani, possui rápido crescimento vegetativo e elevada capacidade de adaptação. Sendo assim para ACBs serem efetivos, é desejável que apresentem elevada população inicial associada a condições ambientais favoráveis a sua multiplicação (BULL, WELLER e TOMASHOW, 1991). 66 Perelló et al. (2009) avaliaram o controle biológico de Septoria tritici em trigo, por isolados de Trichoderma spp. em condições de campo e também avaliaram a eficiência de duas formulações (suspensão de esporos e sementes peletizadas) à base desse microrganismo. Os autores verificaram que não houve diferença entre as formulações testadas. Porém, apontaram que um dos principais problemas que podem afetar as características desejáveis de um produto comercial biológico são as condições de microclima, época de aplicação, características do solo e até mesmo a perda da capacidade de antagonismo durante as etapas de multiplicação em laboratório (PATRÍCIO et al., 2007). Além do fator época de aplicação, o número de pulverizações deve ser considerado dentro da avaliação de doença. A combinação de pulverizações preventivas e curativas podem proporcionar melhor controle da doença por Trichoderma spp. Como encontrado por Lisboa et al. (2007), que utilizou para controle de B. cinerea em tomateiro, pulverizações semanais de T. harzianum, devido à manutenção de alta taxa de propágulos do antagonista no solo. A adição de antagonistas ao substrato de plantas é uma estratégia que pode ser importante no controle de fitopatógenos de solo, porque permite a colonização e o estabelecimento destes agentes antes da sua exposição ao inóculo presente no campo (HARRIS e ADKINS, 1999). 16 c 14 Severidade (cm) 12 10 8 6 a a a a a b b b b b b b b b b b 4 2 0 Tratamentos Figura 07. Severidade da queima-da-bainha (Rhizoctonia solani) com pulverizações de quatro isolados de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52) aplicados em quatro épocas (P 1: cinco dias antes da inoculação de R. solani, P2: simultâneo à inoculação, P3: seis dias após à inoculação; P4: 12 dias após a inoculação). As plantas testemunhas foram apenas pulverizadas com água e inoculadas com o patógeno. Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de ScottKnott ao nível de 1% de probabilidade. 67 c 250 200 ASCPD 150 a a a a a a a b b b b b b b b b 100 50 0 Tratamentos Figura 08. Área Sob a Curva de Progresso (ASCPD) da queima-da-bainha em plantas de arroz pulverizadas com quatro isolados de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52) aplicados em quatro épocas (P1: cinco dias antes da inoculação de R. solani, P2: simultâneo à inoculação, P3: seis dias após à inoculação; P4: 12 dias após a inoculação). As plantas testemunhas foram apenas pulverizadas com água e inoculadas com o patógeno. Médias seguidas por mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a ao nível de 1% de probabilidade. 3.3.2 Avaliação do tratamento de sementes combinado a pulverização curativa de Trichoderma spp. no controle da queima-da-bainha do arroz. O tratamento de sementes combinado com pulverização curativa de Trichoderma spp. reduziu a severidade da doença em relação a testemunha, independente do isolado e época de pulverização. O isolado T.06 E1 (pulverizado sete dias após a inoculação de R. solani) proporcionou menores valores de severidade, 5,55 cm, enquanto a testemunha apresentou média de 10,71 cm (Figura 9). Sendo a eficiência de controle deste tratamento (T.06 E1) de 48,2% comparado a testemunha. Considerando a ASCPD, o isolado T.12 pulverizado sete dias após a inoculação com R. solani, diferiu significativamente da testemunha. Entretanto os demais isolados em todas as épocas de aplicação não diferiram da testemunha (Figura 10). Das variáveis avaliadas quanto à epidemia da doença, a severidade obtida pelo comprimento de lesão diferenciou melhor os tratamentos em comparação à ASCPD. Provavelmente por apresentar menor coeficiente de variação (CV) que foi de 20,06%, comparado ao coeficiente de variação de 25,11% da ASCPD e ainda, considerar todas as avaliações de severidade em relação ao tempo. 68 Comprimento de lesão (cm) 12 b 10 8 6 a a a a a a a a a a a a 4 2 0 Tratamentos Figura 09. Severidade da queima-da-bainha (Rhizoctonia solani) em plantas tratadas via semente com três diferentes períodos de pulverizações foliares curativas (E1: sete dias após a inoculação de R. solani; E2:11 dias após a inoculação de R. solani; E3: 15 dias após à inoculação de R. solani) de quatro isolados de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52). No tratamento testemunha as sementes não foram tratadas e as plantas pulverizadas com água e inoculadas com o patógeno. Médias seguidas de mesma letra não diferem entre si pelo teste de scott-knott, ao nível de 5% probabilidade. 120 b 100 ASCPD 80 60 a ab ab ab ab ab ab ab ab ab ab ab 40 20 0 Tratamentos Figura 10: Área Sob a Curva de Progresso (ASCPD) da queima-da-bainha em plantas tratadas via semente com três diferentes períodos de pulverizações foliares (E1: sete dias após a inoculação de R. solani; E2:11 dias após a inoculação de R. solani; E3: 15 dias após à inoculação de R. solani) de quatro isolados de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52). No tratamento testemunha as sementes não foram tratadas e as plantas pulverizadas com água e inoculadas com o patógeno. Médias seguidas por mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott a ao nível de 5% de probabilidade. O uso de mais de uma variável para avaliar a resposta de um determinado tratamento de controle da doença é recomendado devido às vantagens e desvantagens de cada uma (SILVA; PRABHU e ZIMMERMANN, 2003). No caso da ASCPD que é o produto da 69 severidade no tempo (VAN DER PLANK, 1963; VALE; JESUS JUNIOR e ZAMBOLIM, 2004) tem como vantagens possibilitar a comparação de epidemias entre experimentos, sem a necessidade da avaliação da doença na mesma data, numa determinada fase de crescimento (SHANER e FINNEY,1977). E como desvantagens incluem a não distinção entre baixos níveis de infecção inicial e elevados níveis de infecção tardia (JAMES; SHIH e HODGSON, 1972), que pode ter ocorrido no ensaio. Independente da variável analisada (severidade e ASCPD), a aplicação de Trichoderma logo após o surgimento dos sintomas proporcionou maior redução da queima da bainha em arroz. Indicando que as pulverizações ainda que curativas devam ser realizadas até quatro dias após o aparecimento dos sintomas da doença. Contudo são necessários estudos posteriores a fim de se determinar o número e o intervalo de aplicação para melhor controle da doença. 3.3.3 Efeito do tratamento de sementes combinado a pulverização curativa de Trichoderma spp. na promoção do crescimento de plantas de arroz. A análise das variáveis relacionadas à promoção do crescimento em arroz por Trichoderma spp. encontram-se na Tabela 2. Os isolados T.06, T.09 e T.52 diferiram significativamente da testemunha para o comprimento da parte aérea (CA). Não houve incremento no comprimento de raiz por nenhum dos isolados de Trichoderma testados. O isolado T.12 proporcionou maior incremento da massa seca de parte aérea e raiz de arroz em relação à testemunha e aos demais isolados avaliados. O ganho na promoção do crescimento das plantas de arroz em relação à testemunha foi de 8,1% no comprimento de parte aérea pelo isolado T.52 e o isolado T.12 proporcionou incremento de 61,2% e de 32,9% na massa seca de parte aérea e raiz, respectivamente. 70 Tabela 2. Efeito do tratamento de sementes combinado a pulverização curativa de Trichoderma spp. sobre a promoção do crescimento de plantas de arroz. Comprimento (cm) Massa Seca (g) Tratamentos T.52 T.06 T.09 T.12 Testemunha (água) CV (%) Parte Aérea Raiz Parte Aérea Raiz 79,10 a 21,80 a 2,10 b 0,65 b 75,30 b 20,40 a 1,70 c 0,20 d 74,30 b 20,20 a 1,50 d 0,40 c 71,80 c 19,00 a 3,40 a 0,70 a 72,70 c 21,70 a 1,32 d 0,47 c 2,34 8,30 8,61 19,74 Médias seguidas por mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 1% de probabilidade. O incremento na promoção do crescimento em plantas por espécies de Trichoderma spp. tem sido demonstrado em vários estudos em culturas agrícolas inoculadas com isolados específicos de Trichoderma spp. (KLEFIELD e CHET, 1992; INBAR et al., 1994; YEDIDIA et al., 2000; HARMAN et al., 2004; HOYOS-CARVAJAL; ORDUZ e BISSET, 2009). A promoção do crescimento pode ser evidenciada pelo aumento de biomassa, produtividade, resistência ao estresse e aumento da absorção e solubilização de nutrientes. Vários mecanismos estão envolvidos no estímulo do crescimento das plantas por Trichoderma (ETHUR, 2006). Esses incluem interações com raízes das plantas semelhantes à micorrizas, no qual o Trichoderma penetra e coloniza os tecidos da raiz sem elicitar algum mecanismos de defesa específico contra patógeno (YEDIDIA; BENHAMOU e CHET, l999). Também foi observado por Yedidia et al. (2000) e Hoyos-Carvajal; Orduz e Bisset, (2009) que isolados de Trichoderma produzem metabólitos com atividades análogas a fitohormônios, como ácido indol acético (CUTLER et al., 1989), os que são capazes de solubilizar fosfatos e produzir sideróforos (HOYOS-CARVAJAL; ORDUZ e BISSET, 2009). Em estudos realizados em espécies de feijão, Hoyos-Carvajal; Orduz e Bisset, (2009), observaram maior incremento na biomassa e comprimento de parte aérea e radícula, e ainda em plantas de milho Resende et al. (2004) afirmam ter ocorrido maior acúmulo de matéria seca das raízes. O efeito da aplicação de Trichoderma spp. pode proporcionar aumento dos valores das concentrações foliares dos nutrientes, o que permite interferir sobre melhor 71 absorção dos macro e micronutrientes (PRATES; LAVRES JUNIOR e ROSSI, 2007). Por outro lado, em trabalhos realizados por Carvalho Filho et al. (2008) e Lohmann et al. (2009) com Trichoderma em eucalipto, não foi verificado o incremento na promoção do crescimento. 3.3.4 Efeito de Trichoderma spp. aplicado via tratamento de semente e substrato contra Rhizoctonia solani em arroz Todos os tratamentos (isolados x método de veiculação) reduziram significativamente à severidade da queima da bainha comparado à testemunha (Figura 11). A eficiência de controle do tratamento T.06 M2 (isolado T.06 tratamento de semente via suspensão), em relação à testemunha foi de 50,1%. Trabalhos realizados com T. harzianum no tratamento de semente em tomate promoveram o controle em mais de 70 % da podridão de raiz (F. oxysporum f. sp. radicis-lycopersici) (DATNOFF et al., 1995) e de 87% no tombamento de mudas (Pythium aphanidermatum) (SIVAN; ELAD e CHET, 1984). Comprimento da Lesão (cm) 7 b 6 5 4 3 a a a a a a a a a a a a 2 1 0 Tratamentos Figura 11. Severidade da queima-da-bainha (Rhizoctonia solani) em plantas tratadas com quatro isolados de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52) em diferentes métodos de veiculação (M 1: sementes tratadas com Trichoderma via pó; M2: sementes tratadas com Trichoderma via suspensão; M3: adição de Trichoderma via pó no substrato). As plantas testemunha foram inoculadas com R. solani e não receberam tratamento com Trichoderma spp. Médias seguidas de mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Scott-Knott ao nível de 1% de probabilidade. 72 250 b ASCDP 200 150 a a a a a a a a b b b b 100 50 0 Tratamentos Figura 12: Área Sob a Curva de Progresso (ASCPD) da queima-da-bainha em plantas tratadas com quatro isolados de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52) em diferentes métodos de veiculação (M 1: sementes tratadas com Trichoderma via pó; M2: sementes tratadas com Trichoderma via suspensão; M3: adição de Trichoderma via pó no substrato). As plantas testemunha foram inoculadas com R. solani e não receberam tratamento com Trichoderma spp. Médias seguidas por mesma letra na coluna não diferem entre si pelo teste de Tukey ao nível de 5% de probabilidade. Foram realizadas cinco avaliações de severidade da doença as quais foram utilizadas para calcular a ASCPD (Figura 12). Dos 12 tratamentos avaliados, oito diferiram significativamente a ASCPD em relação à testemunha. Os isolados T.06 e T.52, independente do método de veiculação, foram eficientes na redução da ASCPD, com reduções variando em 36,4% e 27,3%, respectivamente. Enquanto que para os demais isolados variaram a eficiência de acordo com método de veiculação. Os resultados sugerem que os isolados de Trichoderma avaliados são agentes em potencial de biocontrole de R. solani quando utilizados no tratamento de sementes e substrato, podendo reduzir a severidade da queima-da bainha e promover o crescimento de plantas de arroz. 73 3.4 CONCLUSÕES  A pulverização dos isolados de Trichoderma avaliados (T.06, T.09, T.12 e T.52) foram promissores no controle da queima-da-bainha ao longo do cultivo, obtendo ainda melhor sucesso no controle quando pulverizados preventivamente, apresentando menores valores de ASCPD.  A pulverização curativa de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52), quando combinada com o tratamento de semente reduziu a severidade da queima-da-bainha, sendo eficiente na redução da severidade da doença.  Ao combinar o tratamento de semente com pulverização curativa, todos os isolados avaliados foram tidos como promissores quanto à promoção do crescimento.  O tratamento de sementes e do substrato com os isolados de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52) mostrou-se eficiente no controle da severidade da queima-dabainha, principalmente para os isolados T.06 e T.52 que apresentaram menores valores de ASCPD. 74 CONCLUSÕES GERAIS  Os isolados T.06, T.09, T.12, T.52 e T.a reduzem o crescimento de Rhizoctonia solani, in vitro.  Nenhum dos isolados de Trichoderma spp. afetaram negativamente a germinação de sementes de arroz. Enquanto que, apenas os isolados T.12, T.a e T.52 via pó e T. 47 e T.a via suspensão, não afetaram o desenvolvimento radicular de plântulas de arroz.  O isolado T.a aplicado, via suspensão, proporcionou maior desenvolvimento do hipocótilo;  A pulverização dos isolados de Trichoderma avaliados (T.06, T.09, T.12 e T.52) foram promissores no controle da queima-da-bainha ao longo do cultivo, obtendo ainda melhor resultado no controle quando pulverizados preventivamente, apresentando menores valores de ASCPD.  A pulverização curativa de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52), quando combinada com o tratamento de semente reduziu a severidade da queima-da-bainha, sendo eficiente no controle da doença, e promissores quanto à promoção do crescimento.  O tratamento de sementes e do substrato com os isolados de Trichoderma spp. (T.06, T.09, T.12 e T.52) foram eficientes no controle da severidade da queima-da-bainha.  Os isolados T.06 e T.52, aplicados no tratamento de sementes e substrato apresentaram menores valores de ASCPD.  Os de resultados biocontrole sugerem no tratamento que de o semente uso combinado deste agente às aplicações preventivas podem reduzir a severidade da queima-da-bainha e promover o crescimento de plantas de arroz. 75 REFERÊNCIAS AKKOPRU A., DEMIR S. 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