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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO SUDOESTE DA BAHIA – UESB
DEPARTAMENTO DE ESTUDOS BÁSICOS E INSTRUMENTAIS - DEBI
CURSO – ENGENHARIA DE ALIMENTOS
CONTAGEM TOTAL DE MICRORGÂNISMOS PSICRÓFILOS, MESÓFILOS E TERMÓFILOS NO LEITE PASTEURIZADO
Relatório apresentado à professora Lígia Miranda pelos graduandos: Mateus Flores, Tainan Pinheiro, Maira Silva, Lorenna Nyr, Marielle Prates, Josane Cardin e Julia Lacerda; como forma de avaliação da disciplina Microbiologia de Alimentos.
Itapetinga – Bahia
DEZEMBRO - 2011
RESUMO
O Brasil apresenta grande potencial de consumo na produção de lácteos, assim a higiene e o controle do leite e seus derivados, têm como objetivo básico assegurar a inocuidade. A presença de taxas suficientemente altas de certos microrganismos e suas toxinas constituem as causas mais freqüentes de problemas sanitários, além de grandes perdas econômicas. Sendo a contagem microbiana em placa realizada para se avaliar as condições higiênicas na qual o produto foi processado. O objetivo da prática será analisar se há ou não a presença de microrganismos termorresistentes: os psicrófilos, mesófilos e termófilos no leite pasteurizado tipo C, utilizando as técnicas de diluição seriada, plaqueamento diferencial e contagem total de microrganismos. De acordo com a contagem, o mesmo apresentou qualidade microbiológica satisfatória quando comparada aos padrões exigidos internacionalmente. Contudo, a adoção de procedimentos de limpeza completa dos equipamentos de ordenha, processamento e estocagem do leite contribuem para o resultado satisfatório na qualidade do mesmo.
INTRODUÇÃO
O leite é um alimento que possui um perfeito balanço de nutrientes, fornecendo ao homem macro e micronutrientes indispensáveis ao crescimento, desenvolvimento e manutenção da sua saúde. Como fonte de proteína, lipídeos, carboidratos, minerais e vitaminas, torna-se um dos alimentos mais vulnerável a alterações físico-químicas e deterioração por microrganismos. Estes contaminantes podem causam modificações físico-químicas e organolépticas limitam a durabilidade do leite e seus derivados, além de problemas econômicos e de saúde. (Freitas et al.,2002; Lopez e Stamford, 1997;Souza & Cerqueira, 1996).
Segundo Fonseca (1998), o Brasil apresenta grande potencial de consumo na produção de lácteos. Apesar do desenvolvimento tecnológico atingido em certos laticínios, persistem ainda em nível de produção de leite, graves problemas que depreciam a matéria-prima, que impedem o seu beneficiamento para o consumo "in natura" ou tornam o produto beneficiado impróprio para o consumo humano, mesmo nas regiões onde a pecuária leiteira é tradicional.
A higiene e o controle do leite, assim como os produtos lácteos, têm como objetivo básico assegurar a inocuidade. A presença de taxas suficientemente altas de certos microrganismos e suas toxinas constituem as causas mais freqüente s de problemas sanitários, além de grandes perdas econômicas. Os procedimentos dispensados durante a obtenção e manutenção do leite até a sua entrada no estabelecimento de beneficiamento determinam o tipo e a qualidade desses contaminantes. A saúde do rebanho leiteiro, as boas práticas durante a ordenha, a conservação do leite em baixas temperaturas até o momento do processamento são fundamentais para evitar o desenvolvimento dos microrganismos responsáveis pela sua deterioração. (Ponsano et al.,1999)
A contaminação do leite inicia-se na fazenda, durante ou após a ordenha, devido a ineficiência de higienização dos utensílios e do homem, além de doenças do rebanho. Não se deve esquecer que as dificuldades do transporte, falha no processo de beneficiamento e a estocagem podem interferir diretamente sobre a qualidade do leite. Dessa forma, para que seja mantida a qualidade do leite é preciso produzi-lo, pasteurizá-lo, armazena-lo e comercializá-lo de maneira correta, de acordo com os parâmetros técnicos estabelecidos pela legislação. Nos últimos anos, um número crescente de laticínios e cooperativas vêm remunerando o produtor de leite de acordo com a qualidade da matéria-prima fornecida para a indústria. (OLIVEIRA, RICARDO PINHEIRO DE SOUZA. Condições microbiológicas e avaliação da pasteurização em amostras de leite comercializadas no município de Piracicaba. Piracicaba, São Paulo, 2005. 85p.)
Segundo Jay (1996), quando o leite é proveniente de animais sadios e obtidos em condições higiênicas adequadas, o número de microrganismos é baixo, sendo predominantes Micrococcus, Streptococcus e Corynebacterium, além de lactobacilos saprofitas do úbere e canais galactóforos. Dentre os contaminantes estão as bactérias láticas, coliformes, Micrococcus,Staphylococcus, Enterococcus, Bacíllus, esporos de Clostridium e bastonetes Gram-negativos.
Os mesófilos incluem um grupo de microrganismos capazes de se multiplicarem numa faixa de temperatura entre 20 e 45°C, tendo sua temperatura ótima de crescimento a 32°C. Esse grupo é muito importante, por incluir a maioria dos contaminantes do leite, tanto deterioradores como patógenos. É considerado um bom indicador de qualidade microbiológica, sendo a contagem microbiana em placa realizada para se avaliaras condições higiênicas na qual o produto foi processado. Contagens microbianas elevadas de mesófilos no leite pasteurizado podem indicar uma matéria-prima excessivamente contaminada ou permanência em temperatura de abuso, manipulação inadequada, equipamentos da planta de processamento não adequadamente sanitizados e pasteurização deficiente (Rogick, 1987).
As bactérias termófilas são definidas como aquelas que sobrevivem em meios cuja sua temperatura seja alta, possuindo uma temperatura ótima de crescimento de 55 a 65°C, como máximo, para algumas espécies, podendo atingir entre 75 e 90°C e o mínimo em torno de 35°C. O leite cru, normalmente, contem poucas bactérias termófilas, embora com capacidade de se desenvolverem no leite quando mantido a temperaturas elevadas, podendo atingir grandes números destes microrganismos no produto. Essas bactérias constituem problema no leite pasteurizado quando algumas porções são mantidas, por algum tempo, entre 50 e 70°C (Silveira, 1998)
Segundo Collins (1981), de acordo com as normas da Internacional DairyFederation, os psicrotróficos foram definidos como sendo os microrganismos que podem crescer à 7°C ou menos, independente da temperatura ótima de crescimento. Esse grupo é extremamente importante em produtos que são conservados ou armazenados em condições de refrigeração por períodos longos (1 a 4 semanas). O problema torna-se ainda mais sério quando se considera que o uso intensivo da refrigeração, desde a fazenda até a residência do consumidor pode provocar uma gradativa seleção para esse grupo. Os microrganismos psicrotroficos encontrados com maior freqüência em leite refrigerado cru e pasteurizado são do gênero Pseudomonas, por apresentar melhor capacidade de crescimento em ambiente refrigerado do que outras bactérias Gram-negativas.
OBJETIVO
Este trabalho tem como objetivo analisar há presença de microrganismos termorresistentes, que são os psicrófilos, mesófilos e termófilos no leite pasteurizado, caso seja comprovado à existência de algum dos três tipos de microrganismos deve-se explicar por qual motivo este foi encontrado. Estes estudos deveram ser feitos a partir de uma amostra do leite e utilizar as técnicas de diluição seriada, plaqueamento diferencial e contagem total de microrganismos. A partir de estes testes deve-se determinar se o mesmo está dentro dos padrões esperados pela legislação.
MATERIAIS E MÉTODOS
Na aula prática, foram utilizados os seguintes materiais: Uma amostra do leite pasteurizado; 3 tubos de ensaio; 9 placas de Petri, contendo o meio PCA (Ágar Padrão para Contagem); Bico de Bunsen; Pipeta; Alça de vidro; Álcool a 70%; estufa; Geladeira; Contador de Colônias e a Tabela da ANVISA, de UFC/g ou ml.
Primeiramente deve ser feito o Plaqueamento diferencial do leite pasteurizado. Para dar início ao Plaqueamento deve ser feita primeiro a diluição seriada da amostra a ser analisada, o qual para cada 1 ml da amostra deve ser utilizados 9 ml de água Peptonada. A princípio deve-se flambar a pipeta, no bico de Bunsen, e retirar 1 ml do leite pasteurizado, flambar o tubo de ensaio e diluir a amostra em 9 ml de água Peptonada, flambar novamente o tubo fechar e homogeneizar, obtendo o tubo 10-1, flambar o primeiro tubo de ensaio(10-1), retirar 1 ml da primeira diluição, flamba-lo novamente e fechar, flambar o tubo 10-2 e diluir a amostra da primeira diluição em mais 9 ml de água Peptonada, flambar, fechar e homogeneizar o tubo, flamba-lo novamente e retira 1 ml da diluição e flamba-lo, flambar o tubo 10-3 e diluir a amostra coletada na segunda diluição em 9ml de água Peptonada e flambar o tubo, finalizando a diluição seriada e originando-se 3 tubos de ensaio (10-1, 10-2 e 10-3).
Após o termino da diluição seriada, deve ser feito o Plaqueamento diferencial, o qual consiste na retirada de 0,1 ml de cada diluição para serem colocados em placas de Petri contendo o meio PCA, o qual deve ser feito em triplicata, ou seja, 3 placas de Petri para cada tipo de microrganismos. Para esta etapa deve-se flambar a pipeta e começar a coleta das dissoluções pela ordem inversa, do tubo 10-3 ao 10-1, indo sempre do mais diluído até o menos diluído, retirando 0,3 ml de cada tubo de ensaio. Inicialmente deve flambar a pipeta e o tubo de ensaio, retirar 0,1 ml da diluição, flambar o tubo de ensaio e despejar a amostra da diluição na placa correspondente e descartar a pipeta, devido a pequena quantidade coletada, evitando assim a contaminação do meio, deve ser feita a esterilização da alça de vidro no álcool a 70% e flamba-lo no bico de Bunsen, e começar a espalhar a amostra da primeira diluição (10-3) por toda a placa de Petri para que não haja uma superpopulação da mesma, deve-se se repetir este procedimento mais duas vezes para esta mesma placa, a partir dai repetir todo este processo para as outras amostras(10-2 e 10-1), sendo que todo o procedimento deve ser feito ao lado do bico de Bunsen, uma vez que a chama ajudará a deixar o ambiente esterilizado, para finalizar deve-se novamente esterilizar a alça de vidro no álcool e flamba-la. (Figura 1).
Figura 1: Diluição Seriada e Plaqueamento Diferencial
Terminado o processo do Plaqueamento diferencial, as placas devem ficar um período em "descanso" para que o meio possa absorver as amostras, após este pequeno período as placas são invertidas, para que a água de condensação formada na tampa da placa não entre em contato com o meio de cultura, sendo estas devidamente identificadas e levadas para seus locais específicos onde deveram ficar por 24h, sendo que as 3 placas deveram ser condicionas na geladeira, a uma temperatura entre 10 e 12ºC, para a analise dos micro organismos psicrófilos, já para a analise dos mesófilos, as placas devem ficar na bancada a uma temperatura ambiente de aproximadamente 35ºC, para a analises dos termófilos as suas 3 placas correspondentes devem ser condicionadas na estufa a uma temperatura de 45ºC. Após este período de 24h as placas ficaram armazenadas na geladeira até serem utilizadas para fazer a contagem dos microrganismos, lembrando-se que as placas devem continuar invertidas.
Após este período deve ser feita a contagem total das placas, utilizando o contador de colônias, sendo as placas que apresentarem um número de colônias inferior a 25 e superior a 250, são descartadas, as placas que apresentarem confluência de colônias são consideradas incontáveis (INC) e as placas que não apresentarem qualquer tipo de colônia são descartadas, conforme exemplo abaixo (figura 2). Primeiramente analisar se a placa é ou não incontável, caso seja não é necessário coloca-la no contador, já placas contáveis são colocadas no contador, para que então possa ser marcada a quantidade de colônias obtidas, sendo que a metodologia de contagem utilizada na primeira placa deve ser feita nas placas seguintes, neste caso toda a placa foi contada. Após a contagem das colônias, devem ser feitos os cálculos para o UFC/g ou ml, verificando se o leite pasteurizado está ou não impróprio para o consumo, dentro dos padrões da legislação.
Figura 2: Exemplo de cálculo do UFC/g ou ml
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Após a visualização das placas, pode-se observar que as placas destinadas aos microrganismos psicrófilos, não foi obtido nenhum crescimento de colônia, conforme o esperado. Já as placas destinadas aos microrganismos mesófilos e termófilos, foram encontradas crescimento de colônias conforme tabela abaixo:
Tipo de Microrganismo
Nº Placas/ Diluição
10-1
10-2
10-3
Contagem (UFC/ml)
Mesófilos
1
INC
INC
185
1,85 x 104
Termófilos
1
INC
INC
37
3,7 x 103
Tabela 1: Resultados do crescimento de colônias em UFC/ml
Verifica-se na tabela que a população de microrganismos mesófilos encontrada foi 1,85x104 UFC/ml nesta amostra de leite pasteurizado. Em relação aos microrganismos termófilos presentes no mesmo, o número encontrado foi de 3,7x103 UFC/ml. O leite pasteurizado tipo C possui padrão microbiológico estabelecido e este regulamenta, no máximo, 3,0x105 UFC/mL na contagem padrão em placas de microrganismos mesófilos (BRASIL, 2002). Assim, o leite pasteurizado analisado no presente trabalho apresentou-se dentro do padrão.
Segundo PADILHA & FERNANDES (1999), os principais fatores que afetam a qualidade do leite pasteurizado são: qualidade do leite cru, rigor no tratamento térmico, contaminação pós-pasteurização e temperatura de estocagem. Informam ainda que a contaminação pós-pasteurização é considerada um fator que limita a vida comercial.
Comparando os resultados obtidos com os resultados de MARTINS & ALBUQUERQUE (1999), pode-se constatar que o resultado obtido ficou próximo ao resultado do seu experimento, o qual em uma analise de 20 amostras de leite pasteurizado verificaram populações de microrganismos mesófilos entre 103 e 107 UFC/mL, sendo 5 amostras acima do padrão para o grupo microbiano, já na nossa análise foram encontrados mesófilos em uma quantidade de 1,85x104. Segundo os autores, o leite nestas condições apresenta conservação, aumentando assim o risco de infecção microbiana.
Segundo os resultados de SANTOS et al. (2003), na analise das amostras de leite pasteurizado tipo C, foram encontrados populações de mesófilos e psicrófilos inferior a 102 UFC/mL, evidenciando assim que a pasteurização foi capaz de reduzir a carga microbiana destes microrganismos menos resistentes a altas temperaturas em relação ao leite cru.
A contagem padrão em placas, realizada à temperatura de 32°C, no leite, favorece o crescimento de bactérias patogênicas, termodúricas, deteriorantes e outras. Comissão Nacional de Normas e Padrões para Alimentos (CNNPA) regulamentam que a contagem padrão em placas máxima por mililitro de leite não deva exceder o limite tolerado de 4,0x104 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 1978). Normalmente, os produtos que apresentam de 106 a 108 microrganismos por mililitro são sensíveis a sinais de deterioração, indicando, por vezes, leite em natureza excessivamente contaminado, ausência de condições sanitárias e de temperaturas adequadas de beneficiamento e/ou armazenamento. (VIEIRA, S.D.A. 1976).
Segundo PANETTA (1977), não considera os microrganismos termófilos como indicadores da presença de insalubridade do leite pasteurizado, ao comparar as contagens normalmente encontradas àquelas de outros grupos de germes, psicrófilos ou mesófilos. BASAPPA, (1974), porém, consideram-nos de relevante importância, nos leites esterilizados, porque os microrganismos esporo formadores termófilos são responsáveis por degradação proteolítica do produto. Sendo este grupo mais encontrado nos leites pasteurizados, em comparação com os mesófilos e psicrófilos, uma vez que os termófilos são mais resistentes à pasteurização.
Em relação ao leite pasteurizado, alguns cuidados podem ser tomados, sendo importante a utilização de leite cru de boa qualidade, a prevenção da formação de biofilmes nos equipamentos, através da correta higienização e, ainda, que o leite já envasado permaneça sempre em temperaturas ideais (pasteurizado – refrigerado; UHT temperatura ambiente, porem protegido do calor). Ainda na indústria, a análise periódica da eficiência da desinfecção de equipamentos pode auxiliar na detecção de possíveis falhas, corrigindo o problema em tempo hábil evitando assim maiores contaminações.
CONCLUSÃO
A partir dos testes feitos, na amostra do leite pasteurizado, para determinar a quantidade de microrganismos psicrófilos, mesófilos e termófilos, do leite pasteurizado tipo C, apresentou um resultado dentro dos padrões propostos pela legislação brasileira, e em comparação com outros autores.
A adoção de procedimentos de limpeza completa dos equipamentos de ordenha, processamento e estocagem do leite contribuem para uma menor contaminação no leite, apresentando um resultado satisfatório na qualidade deste, uma vez que, a qualidade do leite está intimamente relacionada com o grau de contaminação inicial e com o binômio tempo/temperatura em que o leite permanece desde a ordenha até o processamento.
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