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Sequenciamento de DNA pelo método de Sanger e pelo pirosequenciamento
Acadêmicos: Lenilson Vilela Hélio de Souza Júnior
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS
Biologia Molecular Básica
Profª Draª Mônica
SEQUENCIAMENTO DE DNA A
unidade fundamental de informação nos seres vivos é o gene.
A
compreensão de como a informação é armazenada e utilizada nas células tem representado um caminho para a solução de problemas relacionados à estrutura e função das células.
A
geração de conhecimento em torno dos genes que compõem o genoma dos mais diversos seres vivos é possível por meio da determinação das sequências de nucleotídeos do DNA.
SEQUENCIAMENTO DO DNA Definição Identificação da ordem exata dos pares de bases (A, T, G e C) em um segmento de DNA.
Importância O conhecimento da seqüência de bases de um gene fornece importantes informações sobre sua estrutura, função e relação evolutiva com outros genes (de um mesmo organismo ou de organismos diferentes).
Método de SANGER
Princípio PRINCÍPIO I
- Reação de sequenciamento. É necessária a presença de desoxinucleotídeos, didesoxinucleotídeos terminadores marcados com fluoróforos, primers, TAQ polimerase e o DNA genômico.
II
– Anelamento dos primers no DNA genônico e ligação da TAQ polimerase polimerizando aleatoriamente um deoxinucleotídeo ou dideoxinucelotídeo terminador de cadeia.
III
– TAQ insere um dideoxinucleotideo terminador de cadeia marcado com um fluoróforo que não contem 3´OH interrompendo a polimerização.
Princípio PRINCÍPIO IV
– Criação de fragmentos de DNA clonados de tamanho aleatório.
V
– Separação dos fragmentos em gel de poliacrilamida. A leitura das bases é realizada através do didesoxinucleotídeo terminador marcado com fluoróforo.
VI
– Os diferentes fluoróforos são excitados emitindo comprimentos de onda em frequências diferentes captadas por um fotomultiplicador.
Didesoxinucleotídeo (ddNTP)
desoxinucleotídeo (dNTP)
MÉTODO DE SANGER Método (final
Método (final
Método (final
manual (Radioisótopos) da déc. 70);
semi-automático(Fluoresceínas) da déc. 80);
automático da déc. 90 aos dias atuais).
SEQUENCIAMENTO MANUAL
SEQUENCIAMENTO MANUAL Anelamento do primer Extensão do primer
Terminação da síntese: adição dos ddNTPs Eletroforese em gel de poliacrilamida desnaturante
32P
Autorradiografia
SEQUENCIAMENTO MANUAL Esquema do Sequenciamento de DNA.
SEQUENCIAMENTO MANUAL
LEITURA DA SEQUÊNCIA DE DNA • Manual GATC
LEITURA DA SEQUÊNCIA DE DNA Auto-radiogramas de um gel de seqüenciamento de DNA
Sequenciamento Semi-Automático e Automático
SEQUENCIAMENTO GENÉTICO Leitura Automático Maior avanço no seqüênciamento genético; Uso de terminadores dideoxinucleotídeos com marcadores fluorescentes;
Os terminadores marcados quando estimulados por laser estimulam de forma específica um detector de fluorescência; Softwares específicos fazem a leitura à partir dos detectores.
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO E LEITURA SEMIAUTOMATIZADA
GENÉTICO anelamento dos primers
denaturação
SEQUENCIAMENTO GENÉTICO
LEITURA DA SEQUÊNCIA DE DNA
• Automática
SEQUENCIAMENTO GENÉTICO Leitura Automático
SEQUENCIAMENTO GENÉTICO SEQUENCIAMENTO GENÉTICO Sequenciamento Automático
SEQUENCIADOR
SEQUENCIAMENTO AUTOMÁTICO • Seqüenciadores de capilares - duas vezes mais rápidos, completamente automatizados; • Associação de capilares preenchidos com gel a um sistema de detecção através de fluorescência confocal excitada por laser; • Eliminação da montagem da placa e preparação do gel; • Aplicação das amostras por eletroinjeção;
• Alta velocidade e resolução na separação das amostras.
SEQUENCIAMENTO GENÉTICO SEQUENCIAMENTO GENÉTICO Capilares
SEQUENCIAMENTO GENÉTICO
ABI 3100 sequencer
SEQUENCIAMENTO GENÉTICO SEQUENCIAMENTO GENÉTICO Sequenciamento Automático
SEQUENCIAMENTO GENÉTICO SEQUENCIAMENTO GENÉTICO Sequenciamento Automático
REAÇÃO DE SEQUENCIAMENTO E MARCAÇÃO DO DNA Leitura das sequências Manual Radioisótopos
Leitura das sequências Automática Fluoresceínas
SEQUENCIAMENTO DE SANGER
video
PIROSEQUENCIAMENTO (MARGULIES) Dispensa
a necessidade de vetor. Usa um eficiente método de amplificação in vitro de DNA, conhecido como PCR em emulsão É
uma técnica de “sequenciamento por síntese” que mede a liberação de piro fosfato inorgânico (PPi) por quimiluminescência.
Em
7 horas pode-se produzir um total de 100 milhões de pares de base Enquanto o método de “Sanger” produz apenas 440 mil pares de bases.
Como funciona? COMO FUNCIONA? Shotgun do genoma DNA genômico
Ligação do adaptador e separação em fita simples
Amplificação da amostra baseada em Emulsão A
+ Reagentes PCR + Emulsão de óleo
B Micro-reatores Adaptador carreando a fita de DNA
Fita de DNA e Grânulos de captura
Cria emulsão “água em óleo”
“micro-reatores” Isolado de DNA está contido no grânulo
Deposita-se as “Gotas de DNA” (PicoTiter™Plate)
Grânulos são colocados na placa PicoTiter™ Coloca-se as enzimas
Análise Centrífuga
44 μm
Esquema Óptico
Placa PicoTiter
Reagentes fluem
Síntese
Fótons gerados são capturados pela câmera
Imgem criada pela reação
Estratégias: FASE SÓLIDA FASE LÍQUIDA FASE SÓLIDA: Utiliza DNA imóvel, pré lavagem para
remoção do excesso de substrato após cada adição de um nucleotídeo.
FASE LÍQUIDA: Adição da Apirase ( enzima
degradante de nucleotídeo extraído de batata) permite que seja realizada em um único tubo.
Preparação para o pirosequencimento: Purificação : nucleotídeos excedentes, primers, sais (removidos ou diluídos) Maior qualidade e menor background FASE SÓLIDA: Esferas magnéticas capturam o
produto da PCR Sedimentação Lavagem Desnaturação
FASE LÍQUIDA: Complexo enzimático 35°C
(Apyrase + exonuclease )
2. Insere a placa PicoTiter dentro do instrumento
3. Coloca-se os reagentes em locais específicos
4. Ssequência do genoma é lida em tempo real.
1. Genoma é colocado dentro da placa PicoTiter™
Esquema Geral
Câmera de CCD
Computador
Câmara de fluxo contendo as amostras e as fibras ópticas (1,6 milhões/slide)
Bombeamento de fluídos
Como funciona o pirosequenciamento? Passo 1 Eluição do DNA em um tudo de PCR: Reagentes do PCR incubados com as enzimas ATP sulfurilase, luciferase e apirase, além dos substratos adenosina 5´ fosfosulfato (APS) e luciferina. Passo 2 O primeiro dos quatro desoxinucleotide trifosfatos (dNTPs) é adicionado a reação. A DNA polimerase catalisa a incorporação do dNTP à fita de DNA. Cada evento de incorporação é acompanhada da liberação do pirofosfato (PPi) em uma quantidade equimolar à quantidade de nucleotídeos incorporados.
Passo 3 ATP sulfurilase converte o PPi em ATP na presença de APS. Este ATP dirige a conversão mediada pela luciferase da luciferina em oxiluciferina que gera uma luz visível numa quantidade proporcional à quantidade de ATP. A luz produzida é detectada por uma câmera CCD (charge coupled device) e vista como um pico no pyrogram™.
Cada sinal de luz é proporcional ao número de nucleotídeos incorporados.
Passo 4 A Apirase, uma enzima que degrada nucleotídeos, degrada constantemente os dNTPs não incorporados e o excesso de ATP. Quando a degradação é completada, outro dNTP é adicionado.
Passo 5 A adição de dNTPs é realizada uma de cada vez. À medida que o processo continua, a fita de DNA complementar é formada e a sequência é determinada a partir dos picos do pirograma.
Pirograma
Linearidade é mantida até homopolímeros de 8 nt
Os nucleotídeos foram corridos na ordem T, A, C, G. A primeira das quatro bases constituem a seqüência “chave”, usada para identificar os poços que contém o DNA-carrying bead.
Biotecnologia: o DNA em foco. O Cortinão do Watson.
NDB – Núcleo de Difusão Biotecnológica
Sanger
X
Pirosequenciamento
• Depende de clonagem em bactéria (2 semanas de trabalho)
• Não há clonagem
• 1 milhão de pb em 24 horas
• 25 milhões de bp em 4 horas (100x mais rápido)
• Reads de ~700 bp
• Reads de ~100 bp
• Clones de fita dupla permitem sequenciamento em ambas direções (facilita • orientação 6 meses de e montagem)
sequenciamento, 24 horas por dia, para sequenciar o genoma de um fungo
• Fragmentos fita simples não permitem sequenciamento em ambas direções • 24 horas para sequenciar o genoma de um fungo
FIM
Métodos subsidiários para o diagnóstico da Leishmaniose tegumentar americana (LTA): comparação dos resultados do sequenciamento de DNA e da PCR-RFLP para determinação da espécie de leishmania em amostras cutâneomucosas
UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS Biologia Molecular Básica Acadêmicos: Lenilson Vilela Hélio de Souza Júnior
Profª Draª Mônica Santiago
A doença Doenças É
Infectoparasitárias
uma doença infecciosa, crônica, não contagiosa, caracterizada pelo comprometimento da pele, mucosa e cartilagens. Pode manifestar-se como leishmaniose cutânea localizada (LCL), leishmaniose cutânea difusa (LCD), leishmaniose cutâneo-mucosa (LCM).
Com
o avanço das técnicas de biologia molecular, a PCR (polymerase chain reaction) tem sido utilizada com sucesso no diagnóstico da LTA, pois tem alta sensibilidade e especificidade.
Utilizando
DNA de leishmania obtido de produtos de PCR, tem sido realizado o sequenciamento desse DNA, para identificação e caracterização genômica das espécies de leishmanias.
Região
Nordeste de SP.
Metodologia Levantamento
dos prontuários de152 pacientes com diagnóstico confirmado de LTA. (HC-FMRPUSP)
1993
a 2004, tendo como critério de inclusão ter sido realizada PCR em amostras cutâneomucosas.
A
PCR-RFLP foi realizada nas amostras de PCR positivas dos pacientes, usando a enzima Hae III.
Estatística Teste
binomial ou teste de McNemar para a comparação dos resultados da PCR, sequenciamento e da PCR-RFLP.
Resultados Dos
152 pacientes 114 eram do sexo masculino e 38 eram feminino.
123
pacientes (81%) eram brancos, 20 (13,1%) eram pardos, sete (4,6%) eram negros.
LCD
acometeu 121 pacientes (79,6%), as cutâneo-mucosa e mucosa, 30 pacientes (19,7%).
113
(74,3%), entre 21 e 60 anos; 17 (11,2%) abaixo dos 21 anos; 22 (14,5%) acima dos 60 anos.
O
sequenciamento de DNA do fragmento amplificado pela PCR (102 amostras), 62 (60,8%) resultados positivos e 40 (39,2%) negativos.
Dos
positivos, 40 (39,2%) amostras apresentaram a espécie L. (V.) braziliensis, 20 (19,6%) a espécie L. (L.) amazonensis, uma (1,0%) a espécie L. guyianensis.
Resultados do sequenciamento de DNA e da PCR-RFLP em amostras de pele e mucosa de pacientes com LTA.
Com
a comparação das técnicas realizadas, encontrou-se concordância de resultados em 61 (61%) amostras, isto é, tanto no sequenciamento como na PCR, 33 (33%) amostras apresentaram como resultado a espécie L. (V.) braziliensis.
CONCLUSÃO •O seqüenciamento evidenciou: • 39,2% de casos para a espécie L. (V.) braziliensis •19,6% para L. (L.) amazonensis •1% para L. spp. •1% para L. guyianensis •e 39,2% de resultados não identificados.
CONCLUSÃO •A PCR-RFLP identificou as espécies: • L. (V.) braziliensis em 52% das amostras • L. amazonenesis em 10,7% •L. spp. em 15,3% •e 22% de resultados negativos
CONCLUSÃO •Quando se comparou o seqüenciamento à PCR-RFLP, excluindo os resultados negativos e não identificados obteve-se concordância em : •75% dos casos para L. (V.) braziliensis •e em 20,4% para L. (L.) amazonensis.
OBRIGADO !!!
