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Escolha dos vetores para transformação de plantas
Cassete de expressão: promotor sequência codificadora
Manipulação Genética
sinal de poliadenilação (terminador)
O cassete é agrupado em um vetor adequado: genes de interesse a serem introduzidos genes marcadores para transformação e seleção. origem de replicação. gene de resistência a antibióticos em bactérias.
Adriana Menezes Salgueiro 2012
Promotores Constitutivos Gene marcador
•Promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (35S CaMV) •Ubiquitina Órgão/Tecido-específico •β-Conglicina semente-específico, é a proteína mais abundante da semente da soja. •Rubisco tecido clorofilado. •Patatin tubérculos de batata.
Gene para resistência bacteriana
Gene para seleção de células transformadas
Peptídeo sinal •Peptídeo sinal da subunidade β-Conglicina direciona para os corpos protéicos ou
Genes marcadores de seleção Antibióticos
protein storage vacuoles (PSV).
•Gene neo canamicina, neomicina e gentamicina
•Peptídeo sinal da esporamina para PSV
•Gene hpt higromicina
•Peptídeo sinal + propeptídeo da esporamina vacúolo •KDEL retenção no RE
Herbicidas •Gene arolA glifosato •Gene bar fosfinotricina
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Genes repórteres
Genes repórteres
1ª geração
2ª geração
•Gene nos e ocs isolado de T-DNA de Agrobacterium, nopalina e octopina •Gene lacZ β-galactosidade
•Gene luc luciferase •Gene uidA β-glucuronidase (GUS)
•Gene cat clorafenicol acetiltransferase (CAT)
•Gene gfp GFP
•Gene neo NPTII
Cortes transversais de pecíolo de folha de tabaco transgênico contendo gene GUS sob controle do promotor do gene da PAL de
Arabidopsis
Métodos de transformação de plantas
Genes repórteres
Métodos diretos:
2ª geração •Gene luc luciferase
1. Transformação/Fusão de protoplastos
•Gene uidA β-glucuronidase (GUS)
Isolamento dos Protoplastos:
•Gene gfp GFP
esterilização da superfície de uma folha lavagem da folha em uma solução osmótica retirar a epiderme abaxial ou cortar o tecido para facilitar a penetração da enzima tratamento com a mistura enzimática Purificação do protoplasto isolado Transferência do protoplasto para um meio apropriado.
Métodos de transformação de plantas Métodos diretos:
Métodos de transformação de plantas
A carga negativa da superfície do protoplasto
Métodos diretos:
geralmente faz com que eles sejam repelidos um 1. Transformação/Fusão de protoplastos
dos outros.
1. Transformação/Fusão de protoplastos
Mecânica - pressão Agentes fusigênicos (íons cálcio, polietilenoglicol, NaNO5, gelatina, concA, glicerol, etc) Imunológica - Hartman el al (1973) Antisoro para extratos vegetais (coelho) aglutinação e fusão de protoplastos
Fusion of Protoplasts in an Electric Field (electrofusion; H.-U. KOOP, H.-G. SCHWEIGER, 1985)
de Bromusi, Glycine max e Vicia faba) elétrica Eletroporação Laser – Li et. al. (1999) – fusão de protoplastos de tabaco.
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Métodos de transformação de plantas
Métodos de transformação de plantas
Métodos diretos:
Métodos diretos:
1. Transformação/Fusão de protoplastos
1. Transformação/Fusão de protoplastos
Produtos da fusão de protoplastos: protoplastos não fundidos
Sincárion célula com núcleos não
heterocarion
idênticos fundidos.
homocarion
Cíbrido ou heteroplasto geralmente um núcleo do homocarion desaparece, permanecendo somente o citoplasma dos protoplastos parentais unidos.
Métodos de transformação de plantas
Métodos de transformação de plantas
Métodos diretos:
Métodos diretos:
1. Transformação/Fusão de protoplastos
2. Lipossomos
Seleção dos híbridos somáticos visual Características morfológicas diferentes Marcação fluorescente Citômetro de fluxo
Fig. - Cytology of somatic hybrids between B. napus and O. violaceus and progenies. DAPI (first) and merged (second) images of each cell from GISH analysis were shown. The arrows show the signals from the O. violaceus probe.
Condições de cultura diferenciados
Métodos de transformação de plantas
Métodos de transformação de plantas
Métodos diretos:
Métodos diretos:
3. Biolística ou Biobalística
3. Biolística ou Biobalística
Micropartículas (ouro ou tungstênio) de 0,2 a 0,4 µm de diâmetro Velocidade superior a 1.500km/h
Esquema básico do diagrama de funcionamento do acelerador de micropartículas que utiliza gás hélio a alta pressão.
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Métodos de transformação de plantas
Métodos de transformação de plantas
Métodos diretos:
Métodos diretos:
3. Biolística ou Biobalística
4. Microinjeção
Esquema básico do diagrama de funcionamento do acelerador de micropartículas que utiliza gás hélio a alta pressão.
Métodos de transformação de plantas Métodos indiretos:
Métodos de transformação de plantas Métodos indiretos:
1. Infecção viral
2. Agrobacterium
As Agrobactérias Tipicamente do solo, aeróbicas e Gram-negativas. Pertencem à família Rhizobiaceae O gênero Agrobacterium está subdividido em cinco espécies: A. tumefasciens A. rhizogenes A. rubi (Rubus spp) Using a virus to insert DNA into a cell. The gene is inserted into the genetic make-up of harmless viruses that then invade cells, carrying the gene into the cells.
A. vitis (videiras) A. radiobacter (saprófita) Podem ser divididas em três biovares:
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Métodos de transformação de plantas
Métodos indiretos:
Métodos indiretos:
2. Agrobacterium
2. Agrobacterium
O plasmídeo Ti:
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Métodos de transformação de plantas
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Métodos indiretos:
Métodos indiretos:
2. Agrobacterium
2. Agrobacterium
Indução do sistema de virulência Reconhecimento e fixação da bactéria no tecido vegetal.
Os genes envolvidos na interação agrobactéria-célula vegetal estão localizados no cromossomo da agrobactéria e incluem chvA, chvB, pscA (ou
exoC), att, ahvD, chvE, miaA, ros, chvG, chvI e avcB.
Métodos de transformação de plantas Métodos indiretos: 2. Agrobacterium
A região vir do plasmídeo Ti é formada por um conjunto de seis a mais operons (regulon vir), contendo, aproximadamente 34 genes no total. Os operons da região vir são regulados pelas proteínas VirA e VirG.
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Preparação de uma linhagem de Agrobacterium para ser usada como vetor para a transformação de plantas. 1.Obtenção de linhagens desarmadas As únicas regiões do T-DNA essenciais para a sua transferência são as sequências de 25pb localizadas em suas extremidades. Oncogenes
A região vir, do plasmídeo Ti, também é essencial para a transferência.
iaaM e iaaH via alternativa de biossíntese de auxinas. ipt codifica uma isopenteniltransferase que catalisa a primeira etapa de biossíntese de precursores de citocinina.
Figura – Obtenção de um plasmídeo Ti desarmado. Um plasmídeo contendo regiões de homologia com o T-DNA, no caso o pBR322 (pRB), é introduzido em
Preparação de uma linhagem de Agrobacterium para ser usada como vetor para a transformação de plantas. 2.Preparação de um vetor contendo o T-DNA com os genes de interesse.
Agrobacterium (A). Por meio de
Plasmídeo Ti aproximadamente 200 kb
uma dupla recombinação, o
Tipos de vetores:
plasmídeo pBR322 se integra ao
Binário
plasmídeo Ti causando uma
Co-integrado
deleção (B). O plasmídeo pBR322 não se replica em Agrobacterium, e apenas os recombinantes são selecionados pela resistência à ampicilina. A região deletada contém oncogenes e também não se mantém em Agrobacterium, pois não apresenta origem de replicação (C).
Figura – Sistemas de vetores para a transformação em
Agrobacterium. (A) Sistemas cointegrado: o vetor intermediário integra-se ao plasmídeo Ti por um processo de recombinação simples. O vetor intermediário não se replica em Agrobacterium e apenas os recombinantes são selecionados. (B) Sistema binário: o vetor binário se mantém em
Agrobacterium de forma independente do plasmídeo Ti.
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Métodos para a transferência de vetores de transformação para Agrobacterium
Métodos para a transferência de vetores de transformação para Agrobacterium 2.Eletroporação
1.Conjugação
3.Choque térmico
Figura – Transferência de um vetor para
Agrobacterium por conjugação triparental. O plasmídeo helper (pRK2013) passa para a linhagem de E. coli doadora (A e B) e, a seguir, para a Agrobacterium, promovendo também a transferência do vetor binário (C). O plasmídeo helper não se replica em
Agrobacterium e é eliminado (D). O vetor binário se mantém de forma independente do plasmídeo Ti desarmado (E).
Transformação de plantas com
2.Floral dip (Arabidopsis)
linhagens desarmadas de
Agrobacterium 1.Co-cultivo
Disco foliar
Explante inicial (foliar)
Co-cultura com a bactéria desarmada em meio líquido
Figura – (a) o estágio ideal para o Floral Dip, plantas saldáveis com 20 a 30 inflorescências e algumas silíquas maduras. (b) Plantas invertidas Co-cultura em meio sólido sem antibióticos
com sua porção aérea imersa em uma suspensão de
Agrobacterium por 10s. (c) As plantas são Planta transgênica aclimatada em casa de vegetação.
mantidas embrulhadas em um filme plástico para manter a umidade por 16 a 24h. (d) Após a remoção do plástico a planta é mantida em câmara de crescimento por 1 mês. (e) As sementes são
Meio de enraizamento com ou sem agente de seleção.
Meio de indução de brotos com antibiótico e agente de seleção.
coletadas. (f) A seleção dos transformantes primários é realizada em meio de seleção.
Transformação de plantas utilizando Agrobacterium rhizogenes
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Transformação de plantas utilizando Agrobacterium rhizogenes Genes rol
Transformação de plantas utilizando Agrobacterium rhizogenes Produção de Metabólitos Secundários
rolA provavelmente um membro da família de proteínas ligantes de DNA. rolB mais eficiente na produção de raízes. Plantas transformadas com rolB apresentam um estado hiperauxínico. Indutor mais poderoso do metabolismo secundário e também supressor do crescimento celular. rolC provê o sinal que ativa o metabolismo secundário. rolD codifica a enzima ornitina ciclodesaminase (OCD), que converte ornitina em prolina. Existem evidências que a prolina atue como um indutor da floração. Alguns trabalhos sugerem que rolA e rolB são glucosidases que liberam auxinas e citocininas, respectivamente, da sua forma ligada.
http://www.rootec.com/
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... podem aumentar a resistência à antibióticos?
... podem aumentar a resistência à antibióticos?
... Podem causar o surgimento de superpragas?
... Podem causar o surgimento de superpragas? EFSA (European Food Safety Authority)
OMS, FAO e o OIE têm elaborado estratégias para avaliar riscos e incluir ações de controle e de prevenção: • vigilância dos casos, em pessoas e animais, de resistência aos antibióticos; • a proibição do acréscimo de antibióticos em gêneros alimentícios como rações para animais.
Grupo 1: neomicina e canamicina: Amplamente distribuídos entre as bactérias do solo e entéricas. Não são de grande relevância no tratamento de enfermidades humanas São usadas com restrição na veterinária. São utilizados há mais de 13 anos no desenvolvimento de plantas transgênicas sem nenhum relato de problemas de biossegurança. Higromicina: não é utilizado na antibioticoterapia humana. Grupo 2: cloranfenicol, ampicilina, estreptomicina e espectinomicina: Presentes em microorganismos dispersos no ambiente São usados como terapêutica em áreas definidas da medicina humana e veterinária Utilizados somente para testes de campo e não devem ser usados em plantas que irão chegar ao mercado.
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... podem aumentar a resistência à antibióticos? ... Podem causar o surgimento de superpragas? EFSA (European Food Safety Authority) Grupo 3: amicacina e tetraciclina: Altamente relevantes e de fundamental importância no tratamento de patologias em homens e animais. Devem ser evitados no genoma de plantas transgênicas, e as que os contém não podem ser testadas em campo e NUNCA deverão chegar ao mercado.
Gene de E. coli pmi codifica a proteína fosfomanose isomerase. Manose é tóxico para as células vegetais que o converte em manose-6-fosfato, um inibidor da glicólise. O sistema de seleção PMI/manose é baseado na habilidade das células transformadas de converter a manose-6-fosfato em frutose-6-fosfato, uma vez que possuem a enzima fosfomanose isomerase,
... podem causar alergias?
... podem causar alergias?
introdução de alérgenos
FAO e OMS (2001)
modificação do nível ou natureza de alergénos intrínsicos.
• Fonte do gene • Homologia da sequência com alergénos conhecidos
ALERGIAS
• Reações de associação de IgEs de fontes sorológica de indivíduos alérgicos • Propriedades fisico-quiímicas da proteína codificada pelo gene introduzido
O potencial de alergenicidade de uma proteína não é um parâmetro facilmente previsível
A fonte da proteína é alergênica? SIM
NÃO
É homóloga a algum alérgeno conhecido?
É homóloga a algum alérgeno conhecido?
Varredura sorológica específica
SIM
NÃO
SIM
NÃO
Varredura sorológica
NÃO
NÃO
SIM
Ensaios com animais: resistência a pepsina NÃO
A proteína pode ser alergênica Potencial de Alergenicidade
A soja Transgênica Roundup Ready
Outros Transgênicos que vem sendo Desenvolvidos
3 anos de estudos experimentais
Feijão resistente à vírus (EMBRAPA)
1 ano de avaliação pela CTNBio
Cana de açúcar resistente à broca (Copersucar) Canola resistente à pragas e com óleo mais saudável (EMBRAPA)
a) A soja é uma espécie predominantemente autopolinizada e sem parentes silvestres no Brasil b) Existem no Brasil, pelo menos, três espécies de ervas daninhas naturalmente resistentes ao herbicida glifosato. A utilização deste herbicida no país nas últimas décadas não ensejou o aparecimento de outras espécies a ele resistentes.
Algodão resistente à microorganismo que costumam atacar as plantações (EMBRAPA) Arroz dourado, enriquecido com beta-caroteno Sementes de milho produtoras de hormônio do crescimento (Unicamp)
c) A soja é uma espécie domesticada. d) A utilização do herbicida glifosato, de uso rotineiro nas lavouras de soja no país, não teve efeito negativo no processo de fixação biológica do nitrogênio. e) Não há nenhum efeito documentado de variações de comportamento populacional de insetos benéficos ou de insetos pragas decorrente do uso do glifosato.
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E você, já comeu algum alimento transgênico?
E você, já comeu algum alimento transgênico?
Quem fiscaliza?
Fiscalização
1995 – Lei de Biossegurança (junho 1996) Vinculada ao Ministério da Ciência e Tecnologia É composta por 36 membros das seguintes áreas: Humana Animal
Vegetal Ambiental
Possui representantes nas seguintes entidades: Ministério Ministério Ministério Ministério Ministério Ministério
Competências da CTNBio Estabelecer normas e regulamentos relativos às atividades e projetos que envolvam a construção, cultivo, manipulação, uso, transporte, armazenamento, comercialização, consumo e descarte relacionados a OGMs. Certificar a segurança de laboratórios e experimentos relativos a liberação de OGMs. Fornecer o Certificado de Qualidade em Biossegurança (CQB) 120 instituições possuem o CQB 20 instituições conduzem liberações planejadas no meio ambiente existem cerca de 700 processos de liberação planejada em escala experimental sendo acompanhados pela CTN Bio e apenas um em escala comercial.
da Ciência e Tecnologia da Saúde da Agricultura do Meio Ambiente da Educação das Relações Exteriores
Órgão da Defesa do Consumidor Órgão de Proteção à Saúde do Trabalhador Setor Empresarial de Biotecnologia
O parecer técnico emitido pela CTNBio contempla os seguintes aspectos: a) Riscos ao meio ambiente b) Riscos do ponto de vista agrícola e animal c) Riscos para saúde humana
Art. 16 – compete exclusivamente à CTNBio determinar a paralisação d quaisquer atividades envolvendo OGMs, uma vez constatada a existência de riscos graves para a saúde do homem e dos animais, para as plantas e para o meio ambiente.
Fiscalização É competência os órgãos fiscalizadores do Ministério da Agricultura, do Ministério da Saúde e do Ministério do Meio Ambiente.
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Rotulagem A obrigatoriedade de rotulagem aplica-se a: produtos alimentares contendo genes ou proteínas derivadas de modificação genética
A obrigatoriedade de rotulagem não aplica-se a: Alimentos que involuntariamente contenham menos de 1% de ingredientes geneticamente modificados. Alimentos produzidos a partir de plantas geneticamente modificadas mas que não contenham vestígios dos genes transplantados.
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