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Universidade Estadual do Piauí – UESPI Campus Alexandre Alves de Oliveira Curso: Licenciatura em Ciências Biológicas Disciplina: Imunologia Profª Dra. Dulcecleide Bezerra de Freitas Período 2010.2
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial Thiago Nobre Gomes Monitoria de Imunologia
Sumário
Introdução; Anticorpos ou Imunoglobulinas (Igs); Estrutura dos anticorpos; Anticorpos: chave para o diagnóstico; Metodologias que utilizam reagentes não-marcados; Metodologias que utilizam reagentes marcados; Referências.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Introdução
Imunologia:
Estudo dos mecanismos de resposta do organismo a substâncias estranhas (patógenos) - Antígenos;
Imunidade Adquirida ou Específica:
Humoral; Celular.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Introdução
Auxílio a outras técnicas que são rotina em ambientes clínicos:
Genética e Biologia Molecular moderna; Bioquímica e fracionamento de proteínas;
Existem centenas de técnicas imunológicas; As respostas dos linfócitos também são estudadas.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Anticorpos ou Imunoglobulinas (Igs)
Conceito: Proteínas solúveis que circulam livremente – Globulinas; Encontradas em 2 formas: Secretada (plasmócitos); Ligada à membrana (receptor de LB naiives).
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Anticorpos ou Imunoglobulinas (Igs)
Funções:
Evitam a entrada e disseminação de patógenos; Mediadores da resposta imune humoral; Atravessam a placenta (mãe > feto); Atividade biológica dependente de sua estrutura.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Estrutura dos Anticorpos
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Anticorpos: chave para o diagnóstico
Interações Antígeno-Anticorpo: Medida qualitativa e quantitativa do Ag ou Ac. Investigação celular e molecular: localização e caracterização dos antígenos; A alta especificidade do anticorpo é usada na identificação, isolamento ou quantificação de um antígeno particular. Imunogenicidade; Antigenicidade.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Anticorpos: chave para o diagnóstico
Efeitos da combinação Antígeno-Anticorpo:
Aglutinação: partícula antigênica + Ac específico = agregação de partículas; Precipitação: Ag solúvel + Ac; Ativação do Complemento(C): Ag em solução ou em partícula + Ac específico; Citolise: Célula + anti-célula Ac; Opsonização: Ag + Ac + C aumenta a fagocitose por monócitos ou macrófagos Neutralização: Toxinas, viroses, enzimas + Ac específico = inativação. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Anticorpos: chave para o diagnóstico
Metodologias que utilizam reagentes nãomarcados: 1. Reação de Precipitação; 2. Reação de Aglutinação; 3.Fixação do Complemento.
Metodologias que utilizam reagentes marcados: 4. Quantificação de Antígenos por Imunoensaios; 5. Imunofluorescência; 6. Citometria de Fluxo. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
1. Reação de Precipitação: Quantificação de precipitados formados pela reação AgAc; Pode ocorrem em solução ou gel de agarose.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
Efeito Pró-Zona
Zona de equivalência: Ag-Ac se ligam equimolarmente formando uma rede estável. Excesso de Ag: Os complexos podem ser dissolvidos quando há excesso de Ag pois o Ac fica livre para se ligar a novos Ag adicionados diminuindo a formação de complexos insolúveis. Excesso de Ac: Ocorre redução de imunocomplexos pois todo o Ag está precipitado e fica Ac livre no sobrenadante.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
1. Reação de Precipitação: Efeito Pró-Zona: Excesso de anticorpos na amostra, que ocorre nos soros fortemente reagentes; Pode ocasionar falsos-negativos; Para evitá-lo, emprega-se soro diluído.
Possui sensibilidade de detecção menor quando comparados a outras técnicas imunológicas.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
2. Reação de Aglutinação: Formação de agregados visíveis como resultado da interação de Acs específicos e partículas insolúveis que contêm determinantes antigênicos na superfície; Comparada à precipitação, é mais sensível, necessitando de uma quantidade de Ac 500 vezes menor; Diagnóstico de doenças causadas por vírus, bactérias, protozoários e fungos, doenças auto-imunes, na detecção de hormônios, na tipagem de grupos sanguíneos dos sistemas ABO e Rh, etc. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
2. Reação de Aglutinação Direta:
Partículas que apresentam determinantes antigênicos naturais em sua superfície; Hemácias, bactérias, protozoários, etc; Diluições em série do anticorpo, frente a uma quantidade constante de antígeno; Tipagem ABO e Rh. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
2. Reação de Aglutinação Indireta:
Partículas que apresentam determinantes antigênicos associados a outras superfícies (partículas de látex ou poliestireno) ou superfície de hemácias; Adsorção passiva, adsorção via agentes químicos e conjugação do antígeno; Sua aplicação é muito variada: grande diversidade de Ags que podem se ligar às células.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
3. Fixação do Complemento: Formação de complexos imunes e fixação do complemento por via clássica; Determinação da quantidade de Ag e Ac na amostra; Detecções de Ac em níveis inferiores a 1 µg/mL;
Antígeno misturado com o soro teste; Complemento é ativado; Eritrócitos recobertos com anticorpo são adicionados; A quantidade de lise é limitada ou não. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
Etapas:
Complexo Ag-Ac = complexos imunes; Fixação e consumo do complemento; Se houver complemento: lise celular; Se o complemento foi consumido: não há lise celular.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Anticorpos: chave para o diagnóstico
Metodologias que utilizam reagentes não marcados: 1. Reação de Precipitação; 2. Reação de Aglutinação; 3. Fixação de Complemento.
Metodologias que utilizam reagentes marcados: 4. Quantificação de Antígenos por Imunoensaios; 5. Imunofluorescência; 6. Citometria de Fluxo. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
4. Quantificação de Ags por Imunoensaios:
São os mais utilizados; Ensaios de captura de 2 fases ou pelo ensaio competitivo; Ensaios de fase sólida p/ Acs utilizando ligantes de isótopos radioativos ou com enzimas; Radioimunoensaio (RIE); Ensaio Imunossorvente Ligado à Enzimática (ELISA – Enzime-Linked Immunosorbent Assay); A versão mais comumente usada é o “ensaio em sanduíche”. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
ELISA Sanduíche
Utilização:
Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas; Detecção de antígenos virais e outros patógenos em fezes, urina e secreções.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
ELISA por Competição
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Vantagens do ELISA
Sensibilidade e especificidade maior que o RIA; Reação Ag-Ac é mediada pela atividade enzimática; Utiliza reagentes estáveis; Não utiliza radioisótopos; Não depende de formação de precipitado, aglutinado, etc; Pode ser adaptado tanto a testes simples quanto à automação; Vários testes podem ser realizados simultaneamente. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
5. Imunofluorescência: Um das mais utilizadas no diagnóstico de laboratório para a pesquisa de Acs para Ags celulares e teciduais; Baseia-se na capacidade das moléculas de Ac se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o Ag;
Resultado: microscópio de fluorescência. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
5. Imunofluorescência: Diagnóstico de doenças auto-imunes; Anticorpos monoclonais para a pesquisa de microrganismos e seus componentes em espécimes clínicas. Intensidade de fluorescência de cada célula; Isolamento de diferentes populações celulares c/ diferentes Ags de superfície, corados por diferentes Acs de fluorescência; Direta ou Indireta. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
Direta: se o Ac reagir com o Ag, é visto como uma mancha verde sob luz ultravioleta; Indireta: Ac fluorescente dirigido contra Acs, também funcionando como Ag; melhor visualização que a direta.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
6. Citometria de Fluxo: Separação de células marcadas por fluorescência; Acs dirigidos contra moléculas de membrana ou Ags do Conjunto de Diferenciação (CD); Cada Ac é marcado com um fluorocromo diferente; Teste qualitativo e quantitativo.
Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Interações Antígeno-Anticorpo
Aplicações: Determinar o tipo e nº de células brancas sanguíneas; Isolamento e avaliação de subpopulações celulares, como CD4 e CD8; Distribuição de células de acordo com a densidade dos Ags; Tamanho celular; Uso de múltiplos Acs fluorescentes: diagnóstico do HIV e leucemias agudas. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
Referências
ABBAS, A.K.; LICHTMAN, A. H.; PILLAI, S. Imunologia Celular e Molecular. 6 ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2008.
BENJAMINI, E.; COICO, R.; SUNSHINE, G. Imunologia. 4 ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2002.
ROITT, I.; BROSTOFF, J.; MALE, D. Imunologia. 6 ed. São Paulo: Manole, 2003. Técnicas Imunológicas de Diagnóstico Laboratorial
