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QUIMIOTERAPIA ANTIPARASITÁRIA
“Utilização da amida natural piperina na síntese de novas moléculas, potencialmente úteis na quimioterapia da doença de Chagas. ” Prof. Marco Edilson Freire de Lima Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro ICE - Departamento de Química
Participação dos Produtos Naturais (PN´ (PN´s) no Desenvolvimento de Fármacos * Aspectos históricos.
(P.C.Vieira, et al. al. 2003)
Mercado “Ver o Peso” (Belém-Pará)
* Exemplos de PN´ PN´s utilizados na terapêutica. (E.J.Barreiro, 2006)
OH N N
N H CH3OOC H3CO
OH N R
Catharanthus roseus G. Don
H
H
OCOCH3 CO2CH 3
R=CH3 Vinblastina R=CHO Vincristina
Taxus brevifolia
O O O C6H5
O
C6H 5 O N H
OH
O OH R
HO
Taxol (Paclitaxel )
O O
C 6H5 O
OCOCH3 O HO
OH
10
O
O
Paclitaxel R ou
HO O O
C6H5 O
O
Taxotère
R
O
Taxus baccata
10-desacetilbacatina III
(A.E.Greene, et al. al. 1988)
Participação dos Produtos Naturais (PN´ (PN´s) no Desenvolvimento de Fármacos Produtos naturais
6% Produtos sintéticos modelados a partir de produtos naturais
Biológicos
5%
9% Produtos sintéticos Derivados de produtos naturais
56%
24% (Cragg, et al. 1997)
Table 1: New chemical entities (NCEs) approved between 1975 and 1999 by drug class.
Table 2: Drugs under clinical development for a neglected-disease indication in 2001.
Doença de Chagas
Agente etiológico – Trypanosoma cruzi (Chagas, 1909)
- Até o final da década de 90, estimava-se que cerca de 16-18 milhões de pessoas encontravam-se infectadas pelo T. cruzi na América do Sul (Moncayo, 1999; Kirchhoff, 1993); - A incidência de novas infecções pelo T. cruzi na América Latina teve uma diminuição de mais de 70% por intermédio de controle aos vetores e transfusão sanguínea (Moncayo, 2003); - Apesar de ser uma enfermidade típica de países latinos, já foram constatados casos em países da América do Norte (Schifler et al., 1984; Navin et al., 1985; Kirchhof et al., 1985; Herwaldt et al., 2000).
Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi
http://who.int/tdr/diseases/chagas/lifecicle.html
Formas clínicas da doença de Chagas
Forma Aguda
Forma Crônica INFECÇÃO
* 1 – 4 meses
* 10 – 30% indivíduos infectados Ausência de parasitas no sangue
*Sintomática/Assintomática
Forma Indeterminada Parasitas no sangue
Sinais Clínicos:
* 10 – 30 anos Cardite Progressiva Parasitemia e infiltrado
Sinais clínicos ausentes
(30% casos)
Parasitemia e alterações
Megaesôfago
Histopatológicas discretas
(10% casos)
inflamatório em diversos órgãos
Prata, 1994
Megacólon (10% casos)
Infiltrado inflamatório
Ninho de amastigotas
Prata, 1994
Rossi & Ramos, 1996; Miles et al., 2003
Quimioterapia da doença de Chagas H O2N
NO2
SO2
O N
N
N CH3
H N
N O
Benzonidazol - Roche R (ROCHAGAN )
Nifurtimox - Bayer R (LAMPIT )
Possível mecanismo de ação sobre o parasita parasita:: * Inibição da síntese de DNA, RNA e proteínas pela ação direta do
.
radical nitroânion (R-NO2 ), gerado pela ação de nitroredutases. * Tratamento longo; efeitos colaterais graves; baixa seletividade.
BUSCA POR NOVOS FÁRMACOS APLICÁVEIS AO TRATAMENTO DA DOENÇA DE CHAGAS. (Gutteridge, 1976)
Stoppani (1999); Coura & Castro (2002)
Piperina, amida majoritária nos frutos secos de Piper nigrum
O O
N
O
Semler & Gross (1988)
Algumas Atividades Biológicas da Piperina
•Antitumoral – Pradeep & Kuttan, 2002 •Contraceptiva – Mallini et al.; 1999 •Antibacteriana – Ghoshal et al.; 1996 •Antifúngica – Madhyastha & Bhat, 1984 •Inseticida – Su & Horvat, 1977 •Inibidor do metabolismo hepático (CYP450) – Koul et al., 2002
O O
•Abundância; N
O
•Facilidade de extração; •Material vegetal accessível;
Piperina
•Fonte renovável; Rendimento: 55-7%
•Preparação de derivados (modificação estrutural). estrutural).
Pimenta moída
Brasil: 67.200 ton. IBGE (2003)
Piperina
Extrator de Sohxlet Ikan (1999); Ribeiro et al. (2004) Área de cultivo da pimentapimenta-do do--reino (Pará)
Avaliação da Atividade Citotóxica da Amida Natural Contra EpiEpi- e Amastigotas de Trypanosoma cruzi O
O O O
N
N
N
H
NO2
Piperina
N
Benzonidazol
Epimastigotas (IC50; µM)
Amastigotas (IC50; µM)
7,36
4,91
2,20
2,61 Ribeiro (2004); FreireFreire-dede-Lima (2004)
Viabilidade Celular (%)
Piperina ( µ g/mL )
Azul de Trypan
Ensaio Fagocítico
(0,5)
88 + 3,0
90 + 5,0
(1,0)
82 + 2,0
89 + 4,0
(2,5)
80 + 2,0
85 + 1,0
(5,0)
75 + 2,0
77 + 4,0
O O
N
O
IC50 > 20µM
Estratégias de Modificação Estrutural & Preparação de Análogos Amidas, ésteres, heterociclos Saturação; variação no tamanho da cadeia.
O
O N
O Abertura; outros derivados O-alquil
Derivados substituídos no anel aromático
Preparação de Derivados Acil (Amidas e Éster) O
O O
a
N
O
O
OH 2
O
1 Piperina
O
O O O
Cl 3
b
b
O
R
O 4. R= OC6H11 5. R= NHCH2C6H5 6. R= HN
OC H3
7. R= N[i-CH(CH3)2]2 8. R= Morfolinyl 9. R= N-Metilpiperazinyl
OC H3
a. KOH, etanol, refluxo, 24h; HCl (aq.) até pH 3 (90%); b. (COCl)2, 25oC, 30 min. (100%); c. CH2Cl2, álcool ou amina, 0oC, 1h (70(70-90%).
Modificações na Cadeia Lateral (Dienamida) O O
a
N 10
O O O O
N 1 Piperina
b
O O
N 11
a. Acetato de etila, Pd/C, H2, 2h (90%); b. DIBALDIBAL-H, tolueno, -10oC, 30 min. (80%).
Modificações na Cadeia Lateral (Amida de 3 carbonos) Síntese de Derivados Cinâmicos CHO
O
CO2H
O
a
b
O
O 12 O
13 O N X
O 14 X= CH2 15 X= O
a. Ácido malônico, piridina, piperidina (cat.), refluxo 3h; HCl (aq.) pH=3 (85%). b. (COCl)2, 25oC, 30 min. (100%); CH2Cl2, piperidina ou morfolina, 0oC, 1h (90%).
Modificações na Cadeia Lateral (Amida de 7 Carbonos) Síntese da Amida Natural Piperetina O O
OH
O
a
2
O
16
O
O
O O O
O
c
H 17
O
18
O
O OH
19
d
OC 2H5
O O
b
OH
e
O O
N 20
(26% rend. global, a partir da piperina) a.DIBAL-H, THF, -10oC, 1h (60%); b. MnO2, THF, refluxo, 3h (93%); c. Fosfonoacetato de trietila, THF, NaH, -15oC, 1h (90%); d. KOH, CH3CH2OH, 25oC; HCl (aq.), 0oC (90%); e. (COCl)2, 25oC, 30 min.; CH2Cl2, piperidina, 0oC, 1h (90%).
Atividade antiproliferativa contra T. cruzi (epimastigotas e amastigotas) para o benzonidazol, piperina e derivados. Substância Benzonidazol 1 (Piperina) 2 (Ácido piperínico) 4 (Éster cicloexil) 5 (Amida veratrinil) 6 (Amida benzilinil) 7 (Amida diisopropinil) 8 (Amida Morfolinil) 9 (Amida N-metilpiperazinil) 10 (Tetraidropiperina) 11 (Dienamina) 12 (Cinamamida piperidinil Cadeia C-3) 15 (Cinamamida morfolinil) 20 (Piperetina – cadeia C-7) a
nt, Não testado.
Epimastigotas IC50 (µM) 2,20 7,36 >114,67 >83,33 >81,43 >65,61 14,85 56,13 >83,33 19,41 17,49 >96,52
Amastigotas IC50 (µM) 2,58 4,91 nta nt nt nt 7,77 5,71 nt 11,52 9,63 nt
>95,78 10,67
nt 7,40
Dados de SAR Analisando os dados de atividade antiparasitária, foram obtidas correlações entre a estrutura química e atividade biológica desta classe de substâncias:
O
O
N (1)
O
(IC50=7,36µ µM) - Importância da função nitrogenada: O
O O O
OH (2)
µM) (IC50>114µ
O O
O (4)
(IC50>83,33µ µM)
Dados de SAR O O
N (1)
O
(IC50=7,36µ µM)
- Importância da amida terciária; O O O
N (6)
(IC50>65,61µ µM)
OCH3
O
H
O O
N (5)
H
(IC50>81,43µ µM)
OCH3
Dados de SAR O O
N (1)
O
(IC50=7,36µ µM) - Tamanho da cadeia central, contendo 5 átomos de carbono: O O
n
N
O µM) n= 1 (12) (IC50>96,52µ µM) n= 3 (20) (IC50= 10,67µ
Dados de SAR Os demais derivados de natureza terciária apresentaram uma discreta diminuição da atividade quando comparados à piperina: O
O O O
O
N O
(8)
IC50=56,13
N
O
(10)
IC50=19,41 O O
O
N
N O
O
(11)
(7)
IC50=14,85 O O
IC50=17,49
O N (20)
IC50=10,67
Enzimas chave do metabolismo em tripanossomatídeos como alvos terapêuticos
- Trans-sialidase (Fralish & Tarleton, 2003); - Cisteína proteases (Scheidt et al., 1998); - Tripanotiona redutase (Kruth-Siegel & Inhoff, 2003); -Topoisomerases (Goldenberg et al., 1993); - Glicose 6-fosfato desidrogenase (Duffieux et al., 2000); - 6-fosfogluconato desidrogenase (Bertelli et al., 2001); - Fumarato redutase (Christmas & Turrens, 2000); - Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (Bakker et al., 1999; Souza et al., 1998); - Malato desidrogenase (Knockaert et al., 2002; Montamat et al., 1982) # Baixa similaridade com a enzima de mamíferos (Hunter et al., 2000) # Desempenha funções importantes (Cannata & Cazzulo, 1984)
INVESTIGAÇÃO SOBRE O POSSÍVEL MECANISMO DE AÇÃO:
Efeito inibitório da piperina sobre as isoformas da malato desidrogenase (MDH) em T. cruzi
Mitocôndrial (MDH1) IC50 39,6 µM
150
Glicossomal (MDH2)
B 400 MDH2 (nmol.min-1 .mg-1 )
MDH1 (nmol.min -1 .mg-1 )
A 200
100
50
IC50 36,8 µM
300
200
100
0
0 0
10
20
Piperina (µg/mL)
30
40
0
10
20 Piperina (µg/mL) µ g/ml Piperina.
30
40
Controle (5o Dia)
Pip 10 µg/mL (5o Dia)
F
a
500
b
b
400
Parasitas
a
c F
F
Controle (5o dia) Piperina 10 µg/mL (5o dia)
P
P
F
d
300 200
c
e
100 0
d
e
1K/1N
1K/1N
f
f
P P
P
a
b c Parasitas
400
b F
c
F
d d
2K/2N
2K/2N
Controle (7o dia) Piperina 10 µg/mL (7o dia)
500
a
2K/1N
2K/1N
300 200
e 100 0
F
1K/1N
F
Controle
d (7o
e
Dia)
f
g
Pip 10 µg/mL (7o Dia)
1K/1N
2K/1N
2K/1N
2K/2N
2K/2N
MET de epimastigotas tratados (B, C) ou não (A) com piperina (10 µg/mL) durante 5 dias K V
N
F
M
BF
A V
K K N K K
B
C
MEV de epimastigotas tratados (C, D, E e F) ou não (A, B) com piperina (10 µg/mL)
A
B
C
D
E
F
Taxol, Vincristina, Vinblastina, Ansamitocina e Hemiasterlina
O O O
N Piperina
Morfologia Celular Microtúbulos Ciclo Celular
S G2
Tubulina (Chan & Fong, 1994)
+ G1
M C http://morpheus.fmrp.usp.br/biocell/microtubulos.htm
Simpson & Kretzer, 1997
Síntese de derivados heterocíclicos Transformações na função amida
O O O
Preparação de derivados heterocíclicos do tipo 1,3,4--tiadiazolium 1,3,4
N
Síntese de derivados heterocíclicos Derivados mesoiônicos do tipo 1,3,41,3,4-tiadiazolium
Cl N N S
N H
H3CO
Estratégia de hibridação molecular Fragmento da molécula A + Fragmento da molécula B Molécula C (híbrida) Barreiro e cols. Curr. Med. Chem. 2007, 14,1829.
ESTRATÉGIA PARA A SÍNTESE DO CLORIDRATO MESOIÔNICO (MI), DERIVADO DA PIPERINA
(1,4-DFTSC)
Ikan, 1992; Cheung et al., 1992; Montanari et al., al., 1994; Kappel et al., 2004
METODOLOGIAS SINTÉTICAS
Reagentes: a) KOH/EtOH, refluxo, 20h; b) HCl(10%), até pH3; c) H2(g), Pd/C, AcOEt, t.a., 3h; d) AcOH(glac.), HNO3(conc.), 3h; e) (COCl)2, t.a., 22-3h; f) 1,41,4-DFTSC, 1,41,4-dioxana(anidra), 72h.
METODOLOGIAS SINTÉTICAS
Reagentes: a) ác. Malônico, piridina, piperidina; b) HCl 10%; c) H2(g), Pd/C, AcOEt, t.a., 3h; d) AcOH(glac.)/HNO3(conc.), 3h; e) 1,41,4-DFTSC, TMSTMS-Cl, DMF, 24h; f) (COCl)2, 2 2--3h; g) 1,41,4-DTSC, 1,4 1,4--dioxana (anidra), 72h;
ESTRUTURAS DOS CLORIDRATOS MESOIÔNICOS
RESULTADOS SOBRE EPIMASTIGOTAS
Piperina MI M II M III M IV MV M VI M VII M VIII M IX Benzonidazol
IC50 (µM) Epimastigotas 7,2 10,83 4,13 113,06 31,5 83,42 13,42 45,24 40,82 0,62 2,2
CITOTOXICIDADE PARA MACRÓFAGOS MURINOS • Teste de exclusão do azul de Trypan: MI M II M VI M IX
IC50 (µM) Citotoxicidade Piperina 20 MI 38,56 M II 1,95 M VI 6,62 M IX 1,08
ATIVIDADE ANTIANTI-TRIPOMASTIGOTA IC50 = 6,7 µM
IC50 = >[Max]
IC50 = >[Max]
IC50 = >[Max]
ATIVIDADE ANTIANTI-AMASTIGOTA DMSO 0,01%
MI 1,0 µM
MI 2,2µM
MI 5,4 µM
MI 10,8 µM
MI 21,6 µM
IC50 = 1,35 µM
ATIVIDADE TRIPANOCIDA IN VIVO: VIVO: PARASITEMIA EM CAMUNDONGOS Balb/c • Tripomastigotas sanguíneos:
ATIVIDADE TRIPANOCIDA IN VIVO: VIVO: PARASITEMIA EM CAMUNDONGOS Balb/c • SOBREVIDA :
++
Síntese de outros derivados heterocíclicos
Utilização da estratégia do bioisosterimo no desenho de novos derivados e análogos da piperina (Patani, Chem. Rev., 1996; Wermuth, Medicinal Chemistry, 2008)
Derivados do núcleo 1,3,41,3,4-oxadiazol bioisósteros da amida natural O
O O
O
N
NHNH2
O
O
CS2 NaOH (80%)
3 4 N N N NH O
O
O
S
NaOH
O
etanol RX
O
O 1
S
R
(60-80%) HCHO, etanol amina adequada (60-90%)
O
R N N O
S
R´
O
(Delfini e DeJesus, 32ª RA SBQ, 2009)
Derivados do núcleo 1,2,41,2,4-oxadiazol bioisósteros da amida natural benzoimidoximas
HO O
O O
O
N
O
O
R
Cl CH2Cl2
2 1 O N
H2N O O
H2N
O
O
N
N
Tolueno
O
refluxo
O
N 4
R
(40%)
(Almeida--Soares, 32a RA SBQ, 2009) (Almeida
Síntese de derivados modificados no anel aromático * Estratégias na síntese dos análogos da piperina: - Abertura do anel metilenodioxi (sem sucesso); - Procura de uma alternativa sintética para a preparação de análogos. Eugenol como precursor: precursor: O H 3CO RO
N 5C
H 3CO HO
Amida piperidinil
Eugenol
Síntese de derivados modificados no anel aromático Estratégia em 3 etapas: O P
O H3CO
O N
H3CO
N
RO
CHO
RO
[O]
H3CO HO
O-alquilação
Eugenol
O P
O N
O
SNAc Cl Arbuzov
Cl
Fosfonoacetamida
Barreto-Junior (2005)
Síntese de derivados modificados no anel aromático H3CO
H 3CO
a
HO
CHO
b
HO O
H3CO
H 3CO
CHO c
N
RO
RO R= CH3; iso-C3H7; CH2Ar
a. SeO2, dioxana, refluxo, 3h (30%); b. NaH, THF, RX (90%); c. Fosfonoacetamida, NaH, THF, -30oC - t.a. (80%).
(Barreto-Junior, dissertação M.Sc., 2005; (BarretoSubmetido para publicação, Química Nova, Nova, 2009)
Conclusões & Perspectivas Os resultados obtidos evidenciam a amida natural piperina como um protótipo para o desenvolvimento de novas moléculas aplicáveis ao tratamento da doença de Chagas Chagas..
Os análogos modificados no anel aromático, além dos derivados heterocíclicos obtidos encontramencontram-se em fase de avaliação de suas atividades tóxicas sobre o Trypanosoma cruzi, cruzi, o que nos fornecerá dados adicionais de SAR para esta família de substâncias, além de possíveis derivados/análogos mais ativos.
A avaliação da atividade in vivo do produto natural e alguns derivados encontraencontra-se em andamento.
Conclusões & Perspectivas Os resultados obtidos na investigação dos possíveis mecanismos de ação antiparasitária da amida natural apontam para uma possível interferência do produto natural na citocinese do parasita (tubulina--microtúbulos), o que nos estimulou a avaliarmos a (tubulina piperina, derivados e análogos contra linhagens de células tumorais (carcinoma de Ehrlich), obtendo resultados de toxicidade extremamente promissores promissores..
Avaliação da Atividade Citotóxica de Piperina e Derivados Frente ao Carcinoma de Ehrlich Kenia Pissinate, 28a RA da SBQ, Poços de Caldas - MG (2005) Sessão MD/QO/PN; Dissertação de MestradoMestrado-PPGQO (UFRRJ)(UFRRJ)-2006. (Submetido ao Eur. J. Med. Chem.) Chem.)
Agradecimentos # CNPq - $$$ # FAPERJ - $$$ # CAPESCAPES-PROCAD - $$$ # Prof. Norton Heise (IBCCF(IBCCF-UFRJ) # Profa Lucia MendonçaMendonça-Previato (IBCCF (IBCCF--UFRJ) # Prof. José Osvaldo Previato (IBCCF(IBCCF-UFRJ) # Profa Tecia Ma Ulisses de Carvalho (IBCCF(IBCCF-UFRJ) # Prof. Célio FreireFreire-dede-Lima (IBCCF (IBCCF--UFRJ) # Profa. Aurea Echevarria (Dequim(Dequim-UFRJ) # Dr. Marcos André Vannier e cols. (CPqGM(CPqGM-Fiocruz Fiocruz--Salvador) # Dra. Lucia Pinto da Silva (Dep. Microb. Vet. – UFRRJ)
Agradecimentos # Tatiana Ribeiro (M.Sc. – PPGQ PPGQ--UFRRJ) # Leonardo FreireFreire-dede-Lima (D.Sc. – IBCCF IBCCF--UFRJ) # Cleber Bomfim BarretoBarreto-Junior (M.Sc. – PPGQ PPGQ--UFRRJ) # Rodney Santos (M.Sc. – PPGQ PPGQ--UFRRJ) # Kenia Pissinate (M.Sc. (M.Sc.//D.Sc. – PPGQ PPGQ--UFRRJ) # Tatianny Duvartelli (D.Sc. – PPGQ PPGQ--UFRRJ) # Welisson da Silva Ferreira (M.Sc. (M.Sc.//D.Sc. PPGQPPGQ-UFRRJ) # Breno AlmeidaAlmeida-Soares (M.Sc. – PPGQ PPGQ--UFRRJ) # Natália Drumond Lopes (M.Sc. – PPGQ PPGQ--UFRRJ) # Thiago Graça de Jesus (IC(IC-PIBIC/CNPq PIBIC/CNPq--UFRRJ) # Marco Aurélio Delfini de Oliveira (IC(IC-FAPERJ) # Mirza Nalesso (IC(IC-Monografia Monografia--FAPERJ)
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro Departamento de Química
UFRRJ – ICE DEQUIM
1,4-difeniltiossemicarbazida
