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VALDETE CAMPOS SILVA
ANÁLISE MICROBIOLÓGICA DE ALIMENTOS FRESCOS:
Técnica dos tubos múltiplos e plaqueamento
Este trabalho refere-se a um
relatório de experimento realizado
em laboratório, no intuito de
obtenção de nota da 2º unidade
temática da disciplina Microbiologia
Experimental (UEPB), professora
Weruska Brasileiro.
Campina Grande
2009
1. INTRODUÇÃO
Alimentos frescos são aqueles em que não houve alteração
química, física e biológica, são conservadas as vitaminas e nutrientes,
mais saudáveis e saborosos também. Estão em estreito contato com o ambiente
e passiveis, portanto, de sofrer uma série de transformações. Estas
transformações dependem das características intrínsecas (característica
própria) do alimento, bem como dos fatores extrínsecos (o ambiente em que
se encontra).
Os alimentos frescos apresentam um grau de contaminação
bastante variável, em função das condições de cultivo ou captura, no caso
de produtos de origem animal, mas todos têm uma microbiota natural
posteriormente, com o manuseio em maior ou menor intensidade, contato com
superfícies e equipamentos, transporte e armazenamento, os níveis de
contaminação tendem a se acentuar, muitas vezes com a presença de
microrganismos diferentes daqueles contido na microbiota natural. Nestas
condições a permeabilidade do produto será maior, havendo até riscos quanto
ao aspecto higiênico-sanitário e de saúde publica pela contaminação por
microrganismos patogênicos.
Os fatores que regulam o crescimento de microrganismos que na
maioria das vezes deterioram os alimentos se caracterizam pela: associações
(cria um meio que não é adequado para o outro se desenvolver), efeitos das
condições ambientais, propriedades físicas e químicas do alimento,
disponibilidade de oxigênio e temperatura.
Quando os microrganismos chegam aos alimentos principalmente
se as condições são favoráveis (temperatura, pH, umidade) começam a
multiplicação e crescimento. Para o controle de desenvolvimento de
microrganismos nestes alimentos é interessante que se procure fazer com que
o menor número de microrganismos alcance o alimento, condições
desfavoráveis que tardará o início do crescimento, e tratamentos
diretamente nos microrganismos.
A conservação dos alimentos é para que se elimine totalmente
ou parcialmente os agentes que alteram os produtos na modificação de um ou
mais fatores essenciais onde torne o meio impróprio a qualquer alteração de
vida usando substâncias que impeçam o desenvolvimento de microrganismos
como o caso do formol, por exemplo. Os métodos para tal finalidade são: o
uso do calor e frio, uso do sal, açúcar, fermentação, aditivos, irradiação
e defumação (fumaça que sai da madeira).
Neste experimento foi utilizada a carne moída, alimento este
que tem uma área maior de exposição ao ambiente e podendo ser de fácil
contaminação pelo fato de ser misturada com outros tipos de carnes. A
qualidade e tipo de microrganismo que se desenvolverá na carne dependerão
das condições do animal antes do abate, tais como transporte, condições de
estresse etc. Em se tratando de animal sadio poucos microrganismos são
encontrados, com exceção da superfície externa, dos tratos digestivos e
respiratórios do animal. As espécies mais comuns na contaminação da carne
são: Pseudomonas; Staphylococcus; Micrococcus; Enterococcus e as leveduras.
Quanto aos patógenos, as principais bactérias encontradas na carne são:
Salmonella sp; E. coli patogênica; Yersinia enterocolítica e Clostridium
perfringens.
Utilizando-se como parâmetros microrganismos indicadores de
contaminação fecal, como o grupo coliforme, a qualidade microbiológica pode
ser estabelecida. A Escherichia coli pode atuar como organismo comensal,
patógeno oportunista e patógeno extremamente especializado. A qualidade
microbiológica tem o objetivo de fornecer alimentos seguros, do ponto de
vista higiênico-sanitário. Uma das maneiras de se conseguirem alimentos
seguros é o investimento em técnicas de manipulação adequadas e o
treinamento de manipuladores de alimentos. Esses esforços permitirão a
prevenção de doenças veiculadas por alimentos.
As doenças causadas pela ingestão de alimentos decorrentes de
algum tipo de contaminação microbiana podem ser veiculadas através de
transmissão (cólera,
brucelose, febre tifo), e também como meio de crescimento (infecções
alimentares – depois que o alimento é ingerido - e intoxicações – são
ingeridas juntamente com o alimento).
Para ser um indicador de contaminação fecal ideal é
necessário que tenha como habitat exclusivo o trato intestinal do homem e
animal de sangue quente, ocorrer em números elevados nas fezes, apresentar
alta resistência ao ambiente extra interal, ter técnicas simples e rápidas
para a detecção ou contagem, quando o patógeno associado estiver deve estar
presente, ser de fácil e rápida detecção.
Um alimento quando contaminado por microrganismos do tipo
coliformes totais e/ou termotolerantes pode ser gerado por vários fatores
onde a manipulação inadequada, higienização, conservação, transporte,
manuseio e dentre outros, são talvez as principais causas para que tal fato
aconteça.
Neste relatório estão presentes as seguintes seções:
objetivos, material utilizado, procedimentos, resultados, conclusões e
referências bibliográficas.
2. OBJETIVOS
Análise microbiológica para a detecção de coliformes totais e
termotolerantes pelo Número Mais Provável (NMP), utilizando a técnica dos
tubos múltiplos e plaqueamento para a detecção de E.coli e mesófilos pela
unidade formadora de colônias (UFC).
3. MATERIAL UTILIZADO
Estufa;
Bastão de vidro;
4 placas de Petri;
Erlenmeyer;
16 tubos de ensaio;
Estante p/ tubos;
Pipetas;
Água de diluição estéril;
Caldo lactosado;
Caldo EMB;
Caldo verde brilhante;
Caldo EC;
Balança analítica;
Alça de platina;
Espátula;
Papel alumínio;
14 tubos de Durhan;
Placa aquecedora;
Bico de Bunsen;
Lupa;
4. PROCEDIMENTOS
Primeiro dia:
Com o auxílio da espátula, pesar 10g de carne moída (amostra) e colocá-la
no papel alumínio;
Figura 1: pesagem da
carne moída (10g)
No erlenmeyer colocar a amostra em 90 ml de diluição estéril na proporção
de 1:10, ter o cuidado de homogeneizar bem com o bastão de vidro p/
facilitar na retirada com a pipeta, reserve;
Figura 2: Carne moída dissolvida
Para a diluição pipetar 1 ml da amostra em 9 ml de água estéril, na
proporção de 1:100 e 1:1000. Anotar as proporções nos tubos e reserve;
Figura 3: Água de diluição
No tubo de 1:100 pipetar 1 mL do material do erlenmeyer (1:10) e no tubo
de 1:1000 pipetar 1 mL do tubo de 1:100. Reserve;
Para a preparação das placas de Petri, pipetar 15 mL de agar para
contagem (meio de cultura - APC);
Figura 4: Agar p/ contagem
Pipetar 1 mL do material do tubo 1:100 (c/ diluição) em uma das placas e
na outra 1 mL do tubo 1:1000 (c/ diluição). Anotar as informações
necessárias conforme figura abaixo;
Figura 5: Placas
de Petri
Incubá-las na estufa numa temperatura de 35ºC no período de 24 horas para
a contagem de colônias (mesófilos);
Para a preparação dos tubos de ensaio, separar três séries de três tubos
com caldo verde brilhante com os tubos de Durhan invertidos em seu interior
e apoiá-los na estante;
Na primeira série pipetar 1 mL do material do erlenmeyer, tampar e agitar
bem. Na segunda série pipetar 1 mL do tubo de diluição de 1:100, tampar e
agitar. Na terceira série, pipetar 1 mL do tubo de diluição de 1:1000
tampar e agitar. Fazer as anotações nos tubos conforme figura abaixo;
Figura 6: Todos os tubos
Incubá-los na estufa numa temperatura aproximadamente 35ºC variando ± 2.
Esperar 24 horas para análise dos tubos.
Segundo dia
Tirar da estufa as placas de Petri e fazer a contagem das colônias com o
auxílio da lupa;
Tirar da estufa os tubos, conferi-los e considerar somente os positivos
(presença de gás), descartar o restante;
Preparar outros tubos com caldo EC (5 mL) de forma que fique a mesma
quantidade dos tubos com caldo verde brilhante (os positivos) anteriormente
mencionado, com os tubos de Durhan (invertidos);
Figura 7: Repicagem dos tubos
Fazer a repicagem dos tubos positivos para os tubos com caldo EC com o
auxílio da alça de platina (flambada);
Incubar os tubos repicados por um período de 24 horas na estufa com uma
temperatura aproximada de 45ºC;
P/ a preparação das placas de Petri, pipetar 15 mL de caldo EMB (já
aquecido na placa aquecedora) e esperar esfriar para solidificar;
Figura 8: Meio de cultura Caldo EMB
Fazer os quadrantes e com a alça de platina (flambada) inocular com o
caldo verde brilhante 1:10, na primeira placa e de 1:100 na segunda. No
primeiro quadrante fazer riscos leves (inocular c/ o caldo). Lembrete: toda
vez que inocular a placa, flambar a alça e somente com o caldo no primeiro
quadrante;
No segundo quadrante, inocular de forma que se faça do primeiro quadrante
sempre flambando a alça antes de contactá-la com o meio, e assim
sucessivamente até o quarto quadrante. Fazer isto para as duas placas;
Figura 8: Primeiro quadrante
Figura 9: Demais quadrantes
Fechar as placas e anotar todas as informações necessárias e incubá-las
na estufa numa temperatura de 35ºC aproximadamente por um período de 24
horas.
Figura 11: Placas de 1:10
Figura 10: Placas de 1:100
5. RESULTADOS
A contagem de colônias (placas de Petri) da figura 7 foi bem
significativa na primeira placa num total de 6.600 colônias (unidades
formadoras de colônias - UFC) constatando então a presença de mesófilos
onde a quantidade na placa foram 66 colônias multiplicadas por 100 por
causa da proporção 1:100. Já na segunda placa a quantidade de colônias foi
bem insignificante, não sendo contada.
Figura 12: Quantidade de colônias, esquerda parte de cima da placa e a
direita parte de baixo.
Em relação aos tubos de ensaio foram considerados apenas
cinco tubos positivos por conter a presença de gás em alguns e em outros os
tubos de Durhan suspensos, significam uma amostra com coliformes totais e o
restante (negativos) foi descartado por não haver a presença de coliformes.
Figura 13: Três tubos (gás) Figura 14: Dois tubos (gás)
Figura 15: Nenhum tubo (gás)
De acordo com a tabela exposta em laboratório foi considerado
9,3 o número mais provável (NMP), porque foram 3,2,0 número de tubos
positivos multiplicados por 10 num total de 93.
Figura 16: Tabela do laboratório (UEPB)
Em relação às placas de Petri com o meio EMB foi encontrada
na primeira placa (1:10) a formação de colônias pelo fato de apresentar no
meio uma cor verde brilhante, sendo a maior parte formadora nos dois
primeiros quadrantes. E na segunda placa (1:100) não houve a formação de
colônias talvez por a diluição ser maior, dificultando assim a sua presença
.
Figura 17: Placa 1:10
Figura 18: Placa de 1:100
6. CONCLUSÕES
Houve a presença de coliformes totais em relação às placas
de Petri (figura
12) técnica de contagem de microrganismos com o uso do caldo lactosado que
signi
fica uma carne contaminada e que não deve ser consumida. Esta contaminação
pode ter ocorrido através de algum fator na própria geladeira ou na
exposição ao ambiente.
Quanto à técnica dos tubos múltiplos, também houve a presença
de coliformes na primeira estância e em relação dos tubos resultantes
positivos tratados com caldo EC diagnosticaria a presença de coliformes
termotolerantes, mas por algum motivo não obteve o efeito esperado. Como
apareceu Escherichia coli nas placas de Petri subentende-se que nos tubos
seria presente, pois o este tipo de microrganismo é um subgrupo.
As placas de Petri com o meio EMB (específico p/ coliformes
termotoleran-
tes) apresentou resultados indicativos de contato com contaminantes fecais,
não sendo indicada para o consumo humano.
Todas estas técnicas mencionadas neste experimento são de
extrema importância para a detecção de algum tipo de microrganismos
presentes principalmente em alimentos, seja ele de qual tipo for. De fácil
detecção, no intuito de prevenir eventuais doenças que possa vir a ocorrer
num indivíduo.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Bactérias patogênicas em alimentos minimamente processados, comercializados
na cidade de Pelotas, RS. Disponível em:
http://www.ufpel.tche.br/cic/2007/cd/pdf/CB/CB_00878.pdf Acesso em: 31 Out
de 2009
Conservação de alimentos. Disponível em:
http://www.cena.usp.br/irradiacao/cons_alim.html Acesso em: 1 Nov de 2009
Microbiologia de alimentos. Disponível em:
http://qaonline.iqsc.usp.br:8180/FCKeditor/UserFiles/File/Marcia%20Nitschke/
microalimentos.pdf Acesso em 1 Nov de 2009.
