Relatório 3 - Dosagem Pelo Método Dns

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" IFRJ – Campus Maracanã Coordenadoria de Biotecnologia Disciplina: Tecnologia das Fermentações Turma: BM181 Professores: Sérgio Hélio Kling & José Ricardo Hassel Lopes " " Relatório de Tecnologia das Fermentações Dosagem de Açúcares Redutores pelo Método DNS Avaliação: "Critério: "Nota: " "Apresentação " " "Introdução " " "Objetivos " " "Material Utilizado/ " " "Métodos " " "Resultados " " "Discussão " " "Conclusão " " "Referências " " "Bibliográficas " " "Total: " " Alunos: Alexandre G. Garcez n° 1 Arthur de Lima n° 2 Bruno Oliveira n° 4 Rio de Janeiro, 31 de outubro de 2011. Sumário "Introdução "Pág.: 3 " "Objetivos "Pág.: 4 " "Material Utilizado e Métodos "Pág.: 4, 5" "Resultados "Pág.: 5, " "Discussões "6, 7 " "Conclusão "Pág.: 7 " "Referências Bibliográficas "Pág.: 8 " 1. Introdução Açúcares redutores são todos aqueles que possuem uma hidroxila no carbono anomérico livre, ou seja, sem estar comprometida em uma ligação química, podendo então reduzir outras moléculas com características oxidantes. Esta habilidade pode ser utilizada como instrumento para a quantificação de açúcares. Quantificar açúcares é uma rotina muito importante na rotina de laboratórios ou indústrias comprometidas com os processos fermentativos. A capacidade fermentativa dos microorganismos utilizados nesses processos reflete diretamente na disponibilidade de substratos energéticos para o início das reações que terminarão em um produto desejado. Havendo uma concentração baixa de substrato a probabilidade dos microorganismos encontrarem moléculas para iniciarem a fermentação é mais baixa, o que ocasionaria uma eficiência menor, que é decisiva para o lucro de indústrias que os realizam comercialmente. Em outro extremo, uma quantidade elevada de açúcares pode impedir que a fermentação ocorra nas quantidades desejadas, pois mataria os microorganismos por conta da alta pressão osmótica que um meio hipertônico tem sobre o solvente presente no citoplasmas de suas células. O método DNS utiliza a característica redutora de açúcares para sua quantificação. O princípio vem através de uma molécula chamada Ácido 3,5 – dinitro salicílico (DNS) que quando puro apresenta uma coloração alaranjada, este ácido é facilmente reduzido por açúcares, embora possa apresentar menor eficiência se a solução utilizada possuir outras espécies redutoras fortes. Quando reduzido, o DNS se torna ácido 3-amino – 5 – nitro salicílico, e passa a apresentar-se com uma coloração acastanhada. Através dessa mudança de coloração é possível construir roteiros de ensaios colorimétricos e medir a quantidade de açúcares relacionando a quantidade de DNS reduzido (a estequiometria da reação é 1:1). Todavia, um dos principais substratos para a fermentação de microorganismos é a sacarose, que não possui poder redutor, é necessário neste caso, a hidrólise ácida desses açúcares em glicose e frutose, para apenas depois disto proceder como uma análise pelo método DNS comum. 2. Objetivos Construir uma curva padrão, de dosagem de açúcares por DNS, através de padrões de açúcares de concentrações conhecidas. Determinação do teor de açúcares no caldo de cana, comparando a absorbância lida com as concentrações obtidas pela curva padrão. 3. Material Utilizado e Métodos Material Utilizado: Solução estoque de glicose 10 μmols/mL DNS HCl 2N NaOH 1N Pipetas de 1, 2 e 10mL Tubos de ensaio Tubos Follin Wu Balões Volumétricos de 25 e 200mL Banho Maria a 70°C Termômetro Espectrofotômetro Métodos: Através da solução padrão de glicose foram feitos 25mL de soluções padrões de concentrações 1, 2, 4, 6 e 8 μmols/mL, usando respectivamente, 2.5, 5, 10, 15 e 20 mL do estoque. Dessas soluções foram retiradas alíquotas de 1mL de cada para tubos Follin Wu e adicionados 1mL de DNS, junto a um sexto tubo com 1mL de água destilada e 1mL de DNS para servir como branco na leitura pelo espectrofotômetro. Cada tubo foi então fechado com parafilm e levados a um banho maria a 100°C por 10min. Logo após os tubos esfriarem, avolumou-os até 12,5mL para então realizar uma leitura a 540nm. Após a leitura das absorbâncias para a concentração de uma curva padrão foi utilizada uma amostra de caldo de cana, e dela pipetados 8mL para um balão volumétrico de 200mL, completando com água destilada. Após homogeneizar, 1mL desta diluição foi transferida para um tubo Follin Wu rotulado como AR (Açúcares Redutores Residuais). Paralelamente, 1mL da amostra original do caldo de cana foi transferida para um tubo de ensaio, e acrescentado neste tubo 1mL de HCl, transferindo-o então para um banho maria à 70°C por 10min. Após esfriar foi adicionado 3mL de NaOH para interromper a hidrólise ácida, neutralizando a solução, para só então transferi-la completamente para um balão volumétrico de 200mL avolumando com água destilada. Desta diluição 1mL foi destinada a um tubo Follin Wu, onde foi acrescentado 1mL de DNS, rotulando este tubo como ART (Açúcares Redutores Totais). Este tubo foi avolumado até 12,5mL, e lidos a 540nm assim como os padrões e o branco. 4. Resultados As absorbâncias das soluções padrão, utilizadas por todos os grupos, foram as seguintes: "Concentração de "Absorbância " "Glicose (μmol/mL) "(540 nm) " "1 "0,051 " "2 "0,051 " "4 "0,368 " "6 "0,428 " "8 "0,702 " Das soluções preparadas pelo nosso grupo temos as seguintes absorbâncias: "Solução "Absorbância " " "(540nm) " "Branco "0,066 " "AR "0,888 " "ART "0,968 " Os fatores de diluição utilizados foram os seguintes: AR ( 1:25 + 1:12,5 ART ( 1:200 + 1:12,5 A razão entre as massas de sacarose e seus produtos pode ser obtida por: 342/360 ( 0,95 No gráfico obtemos as concentrações de glicose e frutose através da absorbância (e a equação da reta) e então os valores na solução original através dos fatores de diluição (em mol/100mL), o valor das glicoses e frutoses vindas da hidrólise foi obtida pela diferença entre essas concentrações, que quando multiplicada pelo fator de correção (0,95) chegamos a concentração de sacarose na solução original. Pudemos saber sua concentração em gramas por 100mL através da massa molecular (342g/mol), chegando ao resultado final de 632,7g/100mL. 5. Discussão Sabe-se que a coloração laranja inicial do DNS pode absorver uma pequena quantidade do espectro de luz a 540nm, por isso é necessário o uso de um tubo branco para zerar o espectrofotômetro, garantindo que a leitura das amostras irá desprezar toda luz absorvida por resíduos de DNS que não reagiu. Apenas com a construção de uma curva padrão é possível associar a absorbância lida com concentrações, o mais recomendado é que as absorbâncias das amostras estejam dentro da reta traçada pelos padrões utilizados, porém, como é uma relação linear, só se tornando com um aspecto parecido com uma parábola além do valor de eficiência do equipamento, é possível extrapolar a curva para valores de absorbância inferiores a este limite. Deve se levar em consideração portanto a diluição utilizada, pois soluções muito concentradas vão além da eficiência do equipamento. É possível ler soluções diluídas e multiplicar as concentrações verificadas através da curva pelo fator de diluição utilizado. Como podemos notar no gráfico apresentado obtivemos uma equação da reta, e substituímos nossas absorbâncias nesta equação para obter a provável concentração das amostras de cana de açúcar. Sabe-se que na cana de açúcar temos tanto glicose e frutose, que são açúcares redutores, quanto sacarose. Após a hidrólise ácida da solução temos a quebra de sacarose nesses outros dois açúcares redutores, e podemos ler uma absorbância maior pelo método de DNS. A variação nos dirá quantas glicoses e frutoses foram obtidas através da hidrólise total da sacarose em solução. Porém se observado a reação, notamos que há uma variação de massa, onde a hidrólise necessita do consumo de água para ocorrer, fazendo com que os produtos sejam a soma das massas de sacarose com a de água. É necessário, portanto, multiplicar a concentração obtida por um fator que permita saber a concentração de sacarose original, e não os açúcares que deu origem. Este fator será a razão entre as massas de sacarose e de seus produtos (0,95, vide os resultados). 6. Conclusão Embora tenha erros decorrentes do preparo dos padrões, com absorbâncias idênticas para os padrões de 1 e 2 μmols/mL podemos obter uma equação da reta através dos valores mais bem resolvidos o que diminui a interferência desses valores na concentração obtida através da extrapolação do gráfico. Seria impossível ler, através desta curva, concentrações que se apresentassem entre esses valores, porém a eficiência é considerável para os que superam essas concentrações, como ocorrido nesta prática. 7. Referências Bibliográficas Literatura: 1. SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial: Fundamentos – v. 1 - São Paulo: Edgard Blücher Ltda, 2001. 2. SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial: Engenharia Bioquímica – v. 2 - São Paulo: Edgard Blücher Ltda, 2001.