Dissertação Maria Da Conceição Freitas Moura

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MARIA DA CONCEIÇÃO FREITAS MOURA IDENTIFICAÇÃO MICROSCÓPICA E MOLECULAR DE Olpidium bornovanus E DETECÇÃO DO VÍRUS DA MANCHA NECRÓTICA DO MELÃO EM MELOEIRO NOS ESTADOS DO RIO GRANDE DO NORTE E CEARÁ MOSSORÓ - RN 2012 MARIA DA CONCEIÇÃO FREITAS MOURA IDENTIFICAÇÃO MICROSCÓPICA E MOLECULAR DE Olpidium bornovanus E DETECÇÃO DO VÍRUS DA MANCHA NECRÓTICA DO MELÃO EM MELOEIRO NOS ESTADOS DO RIO GRANDE DO NORTE E CEARÁ Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural do Semi-Árido, como parte das exigências para obtenção do grau de Mestre em Agronomia: Fitotecnia. Orientadora: Profª.D.Sc. Ioná Santos Araújo MOSSORÓ - RN 2012 Ficha catalográfica preparada pelo setor de classificação e catalogação da Biblioteca “Orlando Teixeira” da UFERSA M929i Moura, Maria da Conceição Freitas. Identificação microscópica e molecular de Olpidium bornovanus e detecção do Vírus da Mancha Necrótica do Melão em meloeiro nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará. / Maria da Conceição Freitas Moura. -- Mossoró, 2012. 72 f.: il. Dissertação (Mestrado em Agronomia) Área de concentração: Fitotecnia. - Universidade Federal Rural do SemiÁrido. Orientador: Profº. Ph. D. Ioná Santos Araújo. 1. Cucumis melo L. 2. Solo. 3. Olpidium bornovanus. 4. MNSV. I.Título. CDD: 635.611 Bibliotecária: Vanessa de Oliveira Pessoa CRB15/453 MARIA DA CONCEIÇÃO FREITAS MOURA IDENTIFICAÇÃO MICROSCÓPICA E MOLECULAR DE Olpidium bornovanus E DETECÇÃO DO VÍRUS DA MANCHA NECRÓTICA DO MELÃO EM MELOEIRO NOS ESTADOS DO RIO GRANDE DO NORTE E CEARÁ Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural do Semi-Árido, como parte das exigências para obtenção do grau de Mestre em Agronomia: Fitotecnia. APROVADA EM: 27/07/2012 Aos meus pais, Maria do Céu Freitas Moura, Cícero Leandro Moura Filho (in memoria) e ao meu namorado, Roniedson Carlos Oliveira, pela paciência, carinho, afeto e a presença constante em minha vida. Dedico de coração. A meu querido pai (in memoria) que torceu por essa conquista. Ofereço AGRADECIMENTOS A Deus e a nossa senhora de Fátima por sempre estarem presente em minha vida, iluminando, protegendo e dando-me segurança para vencer os desafios encontrados ao longo da caminhada; Aos meus pais Maria do Céu Freitas Moura e Cícero Leandro Moura Filho (in memoria), pela ajuda, compreensão e pelas palavras de apoio; Ao meu querido namorado, Roniedson Carlos Oliveira, por toda paciência, compreensão, dedicação, incentivo e apoio; A minha adorada sobrinha Jamille Raylane Lima Moura e ao meu irmão Jaques Raylon Freitas Moura, pelo carinho; A todos os familiares, pelo incentivo, apoio e pela força; À minha orientadora e professora Ioná Santos Araújo, pela paciência nos ensinamentos. O meu muito obrigado, aprendi muito com a sua pessoa; Ao professor Rui Sales Júnior, pelas orientações; A todos os colegas, pela ajuda, em especial Ana Patrícia, Samyra, Emanuela, Genilsa, Hailton, Leidiane, João Paulo, Vitor e Isabel. Às minhas amigas Edilma Nascimento e Lindacir Fernandes, pela força e confiança em minha pessoa. Obrigada. À Universidade Federal Rural do Semi-Árido, pela formação profissional adquirida; A CAPES pela concessão da bolsa; Aos funcionários da casa de vegetação, Seu João e Bitinho, pela ajuda na condução do experimento; A Syngenta, em especial a pessoa de Adriana Moreira, pela doação dos reagentes para a condução do trabalho; À pessoa de José Angel Herrera – Vásquez, pelas informações repassadas. O meu muito obrigado. A professora Ludimilla Carvalho, pelas palavras de incentivo e apoio; Os meus sinceros agradecimentos a todos que, de algum modo contribuíram para minha formação e conclusão deste trabalho. RESUMO MOURA, Maria da Conceição Freitas. Identificação microscópica e molecular de Olpidium bornovanus e detecção do Vírus da Mancha Necrótica do Melão em meloeiro nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará. 2012. 72f. Dissertação (Mestrado em Agronomia: Fitotecnia) - Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2012. Os Estados do Ceará e Rio Grande do Norte são os principais produtores de melão da região Nordeste, onde juntos lideram com uma produção em torno de 98,38%. Porém, enfermidades ocasionadas por fungos e vírus têm aparecido com frequência nos campos de produção. Dentre estes, o Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV), o qual tem como principal vetor fungos do gênero Olpidium spp., tem sido de grande preocupação para os produtores dessa cultura, uma vez que os mesmos podem destruir por completo áreas de produção. A sintomatologia que se manifesta na planta, em virtude do ataque desse vírus, é o aparecimento de manchas nas folhas e nos frutos, mudança de coloração da polpa dos frutos, murchamento súbito e, consequentemente, a morte da planta. Diante disso, o objetivo desse estudo foi identificar através de análises microscópicas e moleculares a presença de espécies de Olpidium (O. bornovanus, O. brassicae e O. virulentus) e a nível molecular o MNSV, em raízes de melão cultivadas em solos coletados em diferentes áreas produtoras dos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará. Amostras de solos foram coletadas em 10 fazendas, sendo sete localizadas no Estado do Rio Grande do Norte e três do Estado no Ceará. Em cada fazenda coletou-se um total de cinco amostras de solos, os quais foram postos para a secagem, peneirados, pesados e misturados com areia autoclavada, na proporção de 1:10. Posteriormente, essa mistura foi utilizada para a semeadura com as sementes de melão amarelo (variedade Goldex), e mantidos na casa de vegetação, em delineamento inteiramente casualizado, com cinco repetições cada. Após 30 dias da realização do transplantio, as plantas foram coletadas e suas raízes submetidas ao processo de clarificação para a identificação microscópica do fungo Olpidium spp. Feita essa identificação, realizou-se os estudos moleculares com primers genes específicos para a confirmação da presença do Olpidium e do MNSV. Os resultados obtidos revelaram que das 275 raízes de plantas analisadas morfologicamente, 69,81% apresentaram-se infectadas apenas com o Olpidium bornovanus. Não foi detectada a presença do O. brassicae e nem do O. virulentus. As análises moleculares confirmaram a presença do Olpidium bornovanus bem como também a presença do MNSV, sendo este último constatado em apenas três das 10 fazendas analisadas. Portanto, os solos coletados nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará, tem a presença de Olpidium bornovanus e do MNSV, sendo este, o primeiro relato do MNSV no Brasil. As informações geradas neste estudo são de grande importância para os produtores de melão destas regiões, uma vez que servirão para que medidas de controle sejam realizadas para evitar o alastramento dessa doença nas áreas de cultivo. Palavras-chaves: Cucumis melo L, solo, Olpidium bornovanus, MNSV. ABSTRACT MOURA, Maria da Conceição Freitas. Microscopic and molecular identification of Olpidium bornovanus and detection of Melon Necrotic Spot Virus in melon in the states of Rio Grande do Norte and Ceará. 2012. 72f. Dissertation (M. Sc. In Agronomy/Phytotechny) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2012. The states of Ceará and Rio Grande do Norte are the main melon producers in the Northeast Brazil, together, they lead to a production of about 98.38%. However, diseases caused by fungi and viruses have frequently appeared in the production fields. The Melon Necrotic Spot Virus (MNSV), which has as its main vector the Olpidium spp. fungi, has been of great concern to the productors of this crop, since they can completely destroy the production areas. The symptoms manifested in the plant under the attack of this virus are the appearance of spots on leaves and fruit, change of color of the fruit pulp and plant death. Therefore, the aim of this study was to perform microscopy and molecular identification of the presence of Olpidium (O. bornovanus, O. brassicae e O. virulentus) species and through molecular analysis the presence of MNSV in melon roots grown in soils and collected from different producing areas in the states of Rio Grande do Norte and Ceará. Soil samples were collected from 10 farms, seven ones located in the state of Rio Grande do Norte and three of them in the state of Ceará. In each farm was collected a total of five soil samples, which were placed for drying , sieved, heavy and mixed with autoclaved sand at a 1:10 ratio. Subsequently, this mixture was used for sowing the seeds of yellow melon (Goldex variety), and kept in a greenhouse in a completely randomized design, with five replication each. After 30 days of completion of the transplanting, the plants were collected and their roots submitted to clarification process for identifying microscopic of the Olpidium spp fungus. After the identification was conducter, molecular studies with specific primers genes to confirm the presence of Olpidium spp.and MNSV. The results revealed that from 275 roots morphologically analyzed, 69,81% shown to be infected only with Olpidium bornovanus. We did not detect the presence of O. brassicae and O. virulentus. The molecular analysis confirmed the presence of Olpidium bornovanus and MNSV, the latter being found in only three of the 10 analyzed farms. Therefore, the soils collected in the states of Rio Grande do Norte and Ceará, have the presence of Olpidium bornovanus and of the MNSV, and this is the first report of MNSV in Brazil. The information generated in this study are of great importance to melon farmers in these regions once it will be used to control what measures are taken to prevent the spread of the disease in the cultivation areas. Key-words: Cucumis melo L, soil, Olpidium bornovanus, MNSV. LISTA DE TABELAS Tabela 1 Sequência dos primers genes específicos do Olpidium bornovanus, O. brassicae e O. virulentus............................................................. 43 Tabela 2 Sequência dos primers genes específicos do Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV), baseado nas proteínas p29/28, p7A/p7B, p42........................................................................... 64 LISTA DE FIGURAS Figura 1 – Porcentagem de raízes de meloeiro (Cucumis melo L) infectadas por esporos de resistência de Olpidium bornovanus, cultivados em solos que foram coletados em fazendas localizadas no Estado do Rio Grande do Norte. WA - Fazenda WA; BM – Fazenda Brasil Melon; WG sede – Fazenda WG sede; D – Fazenda Dinamarca; F – Fazenda Frutavida; N- Fazenda Norfruit; WG sum – Fazenda WG sumidouro II. ........................................................................................................ 45 Figura 2 – Amostras de fragmentos de DNA extraídos de raízes de Cucumis melo L amplificados com primers genes específicos de Olpidium bornovanus. M – marcador de peso molecular........................................................................................ 45 Figura 3 – Amostras de fragmentos de DNA extraídos de raízes de Cucumis melo L amplificados com primers genes específicos de Olpidium bornovanus. M – marcador de peso molecular...................................................................................... 46 Figura 4 – Porcentagem de raízes de meloeiro infectadas por esporos de resistência de Olpidium bornovanus, cultivadas em solos que foram coletados em fazendas localizadas no Estado do Ceará. Pal. I e II – Fazenda Palmares; A. Famosa – Fazenda Agrícola Famosa; RBR – Fazenda RBR.............................................................................................. 48 Figura 5 – Amostras de fragmentos de DNA extraídos de raízes de Cucumis melo L amplificados com primers genes específicos de Olpidium bornovanus. M – marcador de peso 49 molecular...................................................................................... Figura 6 – Esporos de resistência do Olpidium bornovanus em raízes de meloeiro cultivadas em solos pertencentes à fazenda Agrícola Famosa Icapuí / Ceará............................................................................................. 50 Figura 7 – Amostras de fragmentos de cDNA de raízes de meloeiro amplificados com primers genes específicos do MNSV. M – marcador de peso molecular; C+ – controle positivo............................................................................................. 65 Figura 8 – Amostras de fragmentos de cDNA de raízes de meloeiro amplificados com primers genes específicos do MNSV. M – marcador de peso molecular; C+ – controle positivo............................................................................................. 66 SUMÁRIO CAPITULO 1 1 INTRODUÇÃO GERAL .......................................................................................... 2 REFERENCIAL TEÓRICO..................................................................................... 2.1 A cultura do melão.................................................................................................... 2.2 Importância econômica do melão............................................................................. 2.2.1 Produção mundial................................................................................................ 2.2.2 Produção no Brasil............................................................................................... 2.3 Fatores que influenciam a cultura do melão.............................................................. 2.4 O Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV)................................................... 2.5 Transmissão do MNSV pela semente....................................................................... 2.6 Olpidium spp e sua relação com o MNSV................................................................ 2.7 Marcadores genes específicos utilizados na detecção de fitopatógenos e vetores de doenças....................................................................................................................... REFERÊNCIAS............................................................................................................ CAPITULO 2 IDENTIFICAÇÃO MICROSCÓPICA E MOLECULAR DE Olpidium spp EM RAÍZES DE Cucumis melo L........................................................................................ RESUMO....................................................................................................................... ABSTRACT................................................................................................................... 1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 2 MATERIAL E MÉTODOS....................................................................................... 2.1 Local do experimento................................................................................................ 2.2 Amostragem do solo................................................................................................. 2.3 Preparo das amostras................................................................................................. 2.4 Análise microscópica do Olpidium ssp..................................................................... 2.5 Análise molecular do Olpidium ssp.......................................................................... 3 RESULTADO E DISCUSSÃO................................................................................. 3.1 Identificação microscópica e molecular do Olpidium bornovanus em amostras de plantas cultivadas em solos do Estado Rio Grande do Norte......................................... 3.2 Identificação microscópica e molecular do Olpidium bornovanus em amostras de plantas cultivadas em solos do Estado do Ceará............................................................. 4 CONCLUSÃO............................................................................................................ 5 REFERÊNCIAS......................................................................................................... CAPITULO 3 IDENTIFICAÇÃO DO VÍRUS DA MANCHA NECRÓTICA DO MELÃO (MNSV) POR ANÁLISE MOLECULAR EM RAÍZES DE MELOEIRO............. RESUMO....................................................................................................................... ABSTRACT.............................................................................................................. 1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................... 2 MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 2.1 Local do experimento................................................................................................ 2.2 Coleta e preparo das amostras................................................................................... 14 17 17 18 18 18 20 22 23 24 25 28 34 34 36 37 40 40 40 41 41 42 44 44 47 52 53 56 56 57 58 61 61 61 2.3Extração do RNA, RT-PCR e PCR com primers genes específicos................................................................................................................... 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................... 4 CONCLUSÃO........................................................................................................ 5 REFERÊNCIAS..................................................................................................... 62 65 69 70 CAPÍTULO 1 1 INTRODUÇÃO GERAL Na família das Cucurbitáceas existem aproximadamente 118 gêneros e 825 espécies descritas. (DOMINGOS, 2002). Muitas dessas espécies são cultivadas em várias regiões do mundo, devido a sua fácil adaptação a vários solos e clima. Elas têm uma importância econômica e social que permite a geração de emprego e renda no semiárido brasileiro. O Nordeste Brasileiro vem se mostrando bastante favorável ao cultivo das espécies das Cucurbitáceas, com enfoque para a produção do meloeiro (Cucumis melo L.) que se destaca com uma produção de 99,93% do total nacional, tendo os Estados do Ceará e Rio Grande do Norte com uma participação de aproximadamente 60,88% e 37,48%, respectivamente. (MDICE, 2011). Entretanto, a cultura do melão, assim como outras culturas de importância econômica sofre interferência de fatores que favorecem o surgimento de doenças. Algumas dessas doenças podem ser provocadas por uma grande diversidade de agentes patogênicos, como bactérias, fungos, nematoides e vírus, o que tem causado a diminuição da produtividade e interferindo na qualidade dos frutos, havendo assim a preocupação dos produtores e demais pessoas envolvidas no processo de produção e comercialização. As enfermidades ocasionadas por fungos e vírus são as que aparecem com maior frequência no cultivo do melão. De todos os patógenos que afetam esta cultura, o mais difícil de combater são os vírus, devido a grande variedade existente. (NAVAL - MERINO, 2005). De acordo com Herrera - Vásquez (2009) o melão, assim como as demais cucurbitáceas são infectadas por numerosos vírus, de sintomas evidentes e de grandes perdas econômicas. Uma vez que uma pequena mancha na casca leva ao descarte do fruto para o mercado, além de elevar o custo de produção com o uso excessivo de defensivos agrícolas. (CÉSAR; SANTOS, 2001). 14 Dentre os vírus de importância econômica na cultura do melão, merece destaque o Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV), pertencente ao gênero Carmovirus da família Tombusviridae. (RIVIERE e ROCHON, 1990). Este gênero de acordo com Brunt et al. (1996) e Büchen - Osmond, (2002) é composto por 22 espécies; e a sua transmissão, segundo os mesmos autores, pode ocorrer de forma mecânica, pela água, insetos, sementes, terra ou fungos, especificamente Olpidium bornovanus (Sahtiyanci) Karling, que é um fungo polífago, de ataque as Cucurbitáceas. Os sintomas apresentados por este vírus consistem em pequenas manchas cloróticas nas folhas, tendendo a evoluir para a necrose. (JORDÁ, 1997). Estas manchas de acordo com Luis - Arteaga (1991) e Cuadrado et al. (1993) medem aproximadamente 0.5 a 2.0 mm de diâmetro, e podem estender-se e evoluir à grandes zonas. Outros sintomas característicos são as necroses das nervuras das folhas inferiores e das intermediárias. (CUADRADO et al.,1993). Também pode atingir o colo e talos das plantas, os pecíolos das folhas e os pedúnculos dos frutos, com o aparecimento de estrias necróticas. O Olpidium ssp. são fungos que habitam o solo, sendo um parasita que ataca as raízes das plantas, cuja principal importância é a transmissão de vírus a várias espécies hortícolas. (ROCHON et al., 2004; SASAYA e KOGANEZAWA, 2006). Dente as espécies do gênero Olpidium, podemos citar o O. bornovanus (Sahtiyanci) Karling, O. brassicae (Woronin) e O. virulentus (Sahtiyanci) Karling. A detecção destes fungos em solo onde espécies de importância econômica são cultivadas pode representar uma ameaça para a introdução do MNSV. A presença do vetor do MNSV, Olpidium bornovanus, no Brasil, mais precisamente nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará, foi detectada pela primeira vez em por Herrera - Vásquez et al. (2009). No que concerne à presença do MNSV, não há relatos na literatura sobre a presença deste vírus no Brasil. A análise morfológica é um dos métodos de detecção da presença de vírus e fungos em plantas. No entanto, para a referida detecção, é necessário primeiramente que a planta manifeste os sintomas dos fitopatógenos. Uma das formas seguras de detecção da presença de fungos e vírus em plantas infectadas, 15 mesmo sem a presença de sintomas, pode ser viabilizado por meio de análises microscópicas e moleculares. Esta última forma de análise tem sido aplicada com sucesso em alguns estudos. (HERRERA - VÁSQUEZ et al., 2009). Porque são utilizados marcadores genes específicos e dão maior confiabilidade aos estudos por se basearem em regiões especificas do DNA da espécie e não sofrerem influência ambiental. Tendo em vista a importância da cultura do melão para o Estado do Rio Grande do Norte e Ceará, e as interferências patogênicas identificadas nesta cultura, principalmente o surgimento de viroses, torna-se necessário realizar estudos que identifiquem a presença precoce de tais patógenos e, desse modo, iniciar a busca por medidas de controle que possam ser úteis para minimizar as consequências negativas ocasionadas à cultura do melão. Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo identificar a presença de fungos do gênero Olpidium (O. bornovanus, O. brassicae e O. virulentus) e do MNSV em plantas de melão cultivadas em solos de diferentes áreas produtoras nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará, por meio de análises microscópicas e moleculares. 16 2 REFERENCIAL TEÓRICO 2.1 A CULTURA DO MELÃO O melão (Cucumis melo L) é uma espécie pertencente à família das Cucurbitáceas. Essa cultura é bastante antiga e acredita-se que tenha se originado na África tropical, difundindo-se dessa região para a Índia e Ásia. (SEYMOUR e MCGLASSON, 1993). Atualmente são conhecidas mais de quarenta espécies do gênero Cucumis, todas nativas das regiões tropicais e subtropicais da África, e por essas evidências, pode-se considerar que o melão tenha essa mesma origem. (FERREIRA et al., 1982). Trata-se de uma planta anual, herbácea, diplóide (2n= 2x=24 cromossomos), com folhas de tamanho e forma bastante variadas, suas flores podem ser monóicas, ginóicas ou, na sua maioria andromonóicas (presença de flores masculinas e hermafroditas) possui um sistema radicular superficial e praticamente sem raízes adventícias, tendo baixa capacidade de regeneração quando danificado, com caule de crescimento rasteiro ou prostrado, e nós com gemas, sendo que dessas gemas desenvolvem-se gavinhas, folhas, novos caules ou ramificações. (FONTES e PUIATTI, 2005). O melão é uma espécie exigente em temperaturas, as quais variam de 28 ºC a 32 ºC para a germinação das sementes, 20 ºC a 32 ºC para a floração e 25 ºC a 30 ºC para o desenvolvimento vegetativo. (NICOLAS et al., 1989) Dentre as variedades de melão, os tipos mais comercializados no Brasil são: Amarelo, Honey Dew, Pele de Sapo, Charentais, Cantaloupes e Gália. Os três primeiros caracterizam-se por apresentarem resistência ao transporte, serem frutos climatérios, sem aroma; possuírem uma elevada vida pós-colheita e são pertencentes ao grupo botânico Inodorus. Os melões do tipo Charentais e Cantaloupes são aromáticos, apresentam alto teor de sólidos solúveis e baixa conservação de vida pós-colheita. O melão Gália, resultado do cruzamento de uma linhagem do melão Ogem com uma do melão Honey Dew, foi desenvolvido em meados da década de 60 por israelenses, sendo o primeiro hibrido a ser 17 desenvolvido por um programa de melhoramento realizado em Israel. (ODET, 1985). Os frutos de melão apresentam-se com formas que variam de esféricas a alongadas, com peso de poucos gramas a vários quilogramas, sabor da polpa de amargo a doce e diferentes colorações de polpa e casca. (STEPANSKY et al., 1999). O fruto se classifica como uma baga, com forma, tamanho e coloração variáveis, contém de 200 a 600 sementes na cavidade central. (PEDROSA, 1997). E a parte comestível é derivada do pericarpo. (PRATT, 1971). O melão é rico em vitaminas A, B, B2, B5 e C, sais minerais como Potássio, Sódio e Fósforo, apresentam valor energético relativamente baixo; podendo ser consumido in natura ou na forma de suco. O fruto maduro tem propriedades medicinais, sendo considerado calmante, refrescante, diurético e laxante. (SENAR, 2007). 2.2 IMPORTÂNCIA ECONÔMICA DO MELÃO 2.2.1 Produção Mundial O continente asiático apresenta 68,37% de produção mundial de melão, seguido pela América com 13,90%, Europa 11,11%, África 6,24% e Oceania 0,38%. (FAO, 2010). A China ocupa a primeira posição em produção mundial de melão, com 11.333.747 toneladas, apresentando uma área colhida de 365.566 ha, seguido pela Turquia com 1.611.700 toneladas e o Iran, com 1.317.600 toneladas. (FAO, 2010). Na América destacam-se os principais países de produção de melão os EUA, México, Guatemala, Brasil, Venezuela, Costa Rica, Honduras e Panamá. No continente europeu, temos a Espanha, Itália, França e Romênia. Na África, o Egito e Marrocos, e na Oceania, a Austrália, com uma produção de 76.300 toneladas. (FAO, 2010). 2.2.2 Produção no Brasil 18 Segundo dados da FAO (2010), o Brasil destaca-se na 12º posição no ranking mundial de produção de frutos do meloeiro. A produção desses frutos no Brasil é de grande importância, em especial para a região Nordeste, que apresenta condições favoráveis para o cultivo, além da geração de emprego e renda para os Estados produtores dessa olerícola. O melão foi introduzido no Brasil na década de 60, e suas áreas produtoras eram principalmente os Estados do Rio Grande do Sul e São Paulo. Mas, como informam Araújo e Vilela (2003), essa produtividade e a qualidade eram limitantes. No entanto, novas regiões que apresentavam condições favoráveis ao desenvolvimento do melão foram se expandindo, e novas áreas foram sendo plantadas para a produção do melão. Conforme Nunes et al. (2004), a produção de melão no Estado do Rio Grande do Norte iniciou-se em 1980, gerando um novo pólo de produção denominado de agropólo Mossoró-Assú. Atualmente, segundo dados do MDICE (2010), a região nordeste é responsável por 99,93% da produção nacional de melão, destacando-se os Estados do Ceará, Rio Grande do Norte, Bahia e Pernambuco. O melão é, portanto, uma cultura de relevante importância sócio-econômica para o Nordeste Brasileiro, tendo alto valor comercial tanto no mercado interno, quanto para exportação. De acordo com Pereira (2009) a área de cultivo destinada aos melões nobres representa cerca de 40% da área total cultivada com melões nos Estados do RN e CE. A maior parte da produção e exportação brasileira encontra-se nos dois principais agropólos: Mossoró-Assú (RN) e Baixo Jaguaribe (CE). Dentre a variabilidade botânica dos melões do grupo Inodorus, o melão amarelo destaca-se com mais de 60% para a exportação, seguido pelos tipos Orange Flesh e Pele de Sapo, com 15,1% e 9,29%, respectivamente. O melão tipo cantaloupense representa aproximadamente 9,0% do melão exportado pelo porto de Natal/RN nos últimos anos. (SALES JÚNIOR et al., 2006). No ranking das frutas brasileiras exportadas em 2009, o melão alcançou o 1º lugar, respondendo por 21% do total dessa exportação, sendo a fruta fresca mais exportada pelo Brasil. Os Estados do Ceará e do Rio Grande do Norte destacam-se como os principais produtores nacionais de melões. (ARAUJO, 2011). 19 Nos principais agropólos acima citados ocorre o desenvolvimento sócioeconômico através da geração de emprego e renda para milhares de pessoas. Daí então, a preocupação dos produtores em produzir melões em qualidade e quantidade para atender o mercado interno e externo. Conforme Crisóstomo et al. (2008) o agronegócio do melão brasileiro é um exemplo típico de evolução rápida para a inserção no mercado global, tendo a participação de grandes, médios e pequenos produtores. 2.3 FATORES QUE INFLUÊNCIAM A CULTURA DO MELÃO A cultura do melão, bem como as demais espécies cultivadas, sofre influência de fatores ambientais. Períodos de dias longos, ausência de geadas, intensa luz solar, calor e ar seco são condições ideais para o cultivo do melão. De acordo com Sousa et al. (1999) e Filgueira et al (2001) o clima semiárido favorece o desenvolvimento das plantas, o que contribui para aumentar a produtividade e a concentração de açúcares nos frutos, tornando-os assim mais ricos em sabor e aroma, com polpa mais consistente e de melhor conservação, características imprescindíveis para a exportação. Conforme Silva e Costa (2002) dentre os fatores climáticos que afetam diretamente a cultura do melão, o principal é a temperatura, tanto a do ar quanto a do solo, que podem influenciar desde a germinação da semente até a qualidade final do fruto. Existem regiões do Nordeste Brasileiro que apresentam condições favoráveis de umidade relativa do ar durante todo o ano, o que favorece para a produção de frutos de melão com alto teor de açúcares. No entanto, existem regiões que apresentam altos índices pluviométricos, elevada umidade relativa do ar por longos períodos e excesso de umidade no solo, o que interfere o cultivo do melão, principalmente, ao surgimento de doenças, diminuição da resistência foliar e pelo efeito das chuvas na qualidade dos frutos. (ELMSTROM e MAYNARD, 1992). Dentre as doenças que acometem a cultura do meloeiro, os agentes patogênicos que tem aparecido com frequências nos campos de produção dessa 20 cultura, são as bactérias, fungos, nematóides e os vírus, o que vem causando a diminuição da produtividade e interferências na qualidade dos frutos, havendo assim a preocupação dos produtores e demais pessoas envolvidas no processo de produção e comercialização do melão. Dentre os vírus infectantes das cucurbitáceas já foram relatados no Nordeste Brasileiro: a Família Bromoviridae, gênero Cucumovirus: Cucumber mosaic vírus-CMV; Família Comoviridae, gênero Comovirus: Squash mosaic virus –SqMV; Potyviridae, gênero Potyvirus: Papaya ringspot virus, type watermelon – PRSV-W; Watermelon mosaic virus –WMV; Zucchini yellow mosaic virus – ZYMV. (OLIVEIRA et al., 2000; MOURA et al., 2001). E o vírus do amarelão, que vem causando sérios prejuízos na cultura do melão e cuja etiologia foi sugerida por Lima et al. (2002) como um possível vírus da família Closteroviridae, gênero Crinivirus, que de acordo com Nagata et al. (2005) se trata de um vírus da família Flexiviridae, gênero Carlavirus. No Brasil, mais atenção tem sido dada aos vírus da família Potyviridae por representarem fatores limitantes ao cultivo de Cucurbitáceas nas principais regiões produtoras do país. (RAMOS et al., 2003). As plantas infectadas por vírus, como citam Ramos et al. (2003) podem apresentar mosaico, redução do limbo foliar, deformação nas folhas e frutos, podendo variar de acordo com o hospedeiro infectado, bem como a ocorrência de infecções mistas. Estudos realizados por Ramos et al. (2003) com três espécies de vírus do gênero Potyvirus, em três híbridos do melão (Hy Mark, Gold Mine e Orange Flesh) verificaram que os sintomas exibidos pelos híbridos de Hy Mark, Gold Mine e Orange Flesh, quando inoculados com PRSV, WMV e ZYMV isoladamente, manifestaram-se de forma típica para cada um dos vírus em questão. Dentre esses, o ZYMV mostrou-se mais severo. A doença ocasionada pelo ZYMV conforme Provvidenti et al. (1984), Oliveira et al. (2000) é considerada uma das viroses mais destrutivas nas Cucurbitáceas, ocorrendo, tanto nos trópicos, como em regiões temperadas. Mesmo menos severo quando comparado com o ZYMV, o PRSV pode ser considerado fator limitante na produção de diversas Cucurbitáceas, 21 principalmente quando a infecção ocorre no início do ciclo. (BHARGAVA, 1977; OLIVEIRA et al., 2000). Atualmente tem-se observado a presença do Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV) em alguns países da América latina, África, Ásia e Europa. Esse vírus, conforme Hibi e Furuki (1985) têm infectado diversas espécies das famílias das Cucurbitáceas, dentre elas, o melão (Cucumis melo) pepino (Cucumis sativus L) e a melancia [Citrullus lanatus (Thunb.) Matsum. e Nakai] 2.4 O VÍRUS DA MANCHA NECRÓTICA DO MELÃO (MNSV) O Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV), pertence ao gênero Carmovirus, da família Tombusviridae. (RIVIERE e ROCHON, 1990). O gênero Carmovirus, de acordo com Büchen - Osmond, (2002) é composto por 22 espécies. A sua transmissão na maioria das vezes ocorre de forma mecânica, outras podem ser transmitidas pelos insetos, semente e fungos, especificamente o Olpidium spp. Os dois últimos meios de transmissão são os mais importantes para o MNSV. Os sintomas ocasionados por esse vírus consistem em pequenas manchas cloróticas nas folhas, tendendo a evoluir para a necrose. (JORDÁ, 1997). Estas manchas de acordo com Luis - Arteaga (1991); Cuadrado et al. (1993) medem aproximadamente 0,5 a 2,0 mm de diâmetro, e podem se estender e evoluir a grandes zonas. Outros sintomas característicos são a necrose das nervuras das folhas inferiores e as das intermediárias. (CUADRADO et al.,1993). Os sintomas aparecem também como estrias necróticas no colo e talos das plantas, nos pecíolos das folhas e nos pedúnculos dos frutos. Uma necrose marrom pode aparecer na base do talo, afetando somente a epiderme, e podendo provocar a morte da planta por desidratação. (CUADRADO et al.,1993). Geralmente os frutos não são afetados, em algumas ocasiões pode notar na casca um aspecto rugoso e cortíceo, já as polpas podem apresentar uma coloração marmoreada. (HERRERA-VÁSQUEZ, 2009). Outra manifestação frequentemente vista é o murchamento súbito, o que leva a morte das plantas. Esta sintomatologia é 22 denominada no sudeste da Espanha como “morte súbita ou colapso do melão”. (JORDÁ, 1997). No que diz respeito ao estado vegetativo da planta, os sintomas apresentados por essa doença aparecem principalmente durante a maturação e a colheita dos primeiros frutos. (CUADRADO et al.,1993). A sua gravidade virulenta aumenta de acordo com as condições ambientais, como um fotoperíodo curto e uma temperatura relativamente baixa. Fatores esses climáticos que explicam a ocorrência acentuada da doença em períodos de invernos, primavera e outono. 2.5 TRANSMISSÃO DO MNSV PELA SEMENTE As infestações nas sementes por vírus é um dos fatores que interferir na qualidade e produtividade das plantas, pois muitos campos de produção tiveram seus cultivos comprometidos em razão de danos ocasionados nas sementes por fitopatógenos. A preocupação com a qualidade sanitária das sementes é um fator importante a ser considerado. (MARRONI, 2006). A transmissão de fitopatógenos por sementes é um ponto de partida inicial para a introdução de enfermidades nas áreas de cultivos. De acordo com Sellés (2010) as infestações ocorrem nas primeiras etapas de desenvolvimento da plântula, etapa essa decisiva para a severidade da infecção viral. À aparição e distribuição de plântulas infectadas nos campos de produção, consistirá em reservatórios de focos de dispersão secundaria da doença, que podem ser transmitidas a plantas sadias através da forma mecânica, como também por vetores. Conforme Gonzalez - Garza et al. (1979) um dos mais importantes tipos de transmissão do MNSV é pela semente. O vírus é transmitido pela semente independente do vetor, mas com a presença de Olpidium spp a extensão da disseminação do MNSV aumenta. Campbell et al. (1996) observaram que com a ausência do Olpidium bornovanus, a transmissão do MNSV pelas sementes em plântulas de melão foi de 0,1 % e 0,04%, respectivamente. Porém, quando o vetor estava presente, a transmissão nas plântulas foi maior do que 50%. Entretanto, 23 alguns trabalhos indicam que o índice de transmissão do MNSV pela semente, foi de 0 a 20%. (KISHI, 1966; GONZALEZ - GARZA et al., 1979; YOSHIDA et al., 1980; AVGELIS, 1985). Assim, há controvérsias a respeito do índice de transmissão do vírus pela semente. A localização do MNSV na semente ocorre na superfície e no endosperma, desse modo, segundo Campbell et al. (1996) é provável que a transmissão do MNSV para a semente ocorra durante o desenvolvimento da mesma ou quando as mesmas são extraídas dos frutos. Muitos tratamentos têm sido utilizados para reduzir a incidência de fitopatógenos em sementes, dentre os tratamentos, podemos citar, tanto os através de métodos físicos como os tratamentos químicos. Sellés et al. (2007) ao estudarem a eficácia na desinfecção no tratamento do Pepino mosaic virus em sementes de tomate, verificaram que o melhor resultado, foi utilizando a solução de fosfato trissódio a 10% por 3 horas. Herrera - Vásquez et al. (2009) realizaram um estudo para avaliar o melhor tratamento para a desinfecção do MNSV em sementes de melão. Nesse estudo, os autores acima citados, utilizaram tratamentos térmicos e também tratamentos químicos para a erradicação do MNSV nas sementes das plantas de melão da cultivar Gália. 2.6 Olpidium spp e sua relação com o MNSV O Olpidium ssp. são fungos que habitam o solo, sendo um parasita que ataca as raízes das plantas, cuja principal importância é a transmissão de vírus a várias espécies hortícolas. (ROCHON et al., 2004; SASAYA e KOGANEZAWA, 2006). As espécies de Olpidium bornovanus, O. brassicae e O. virulentus, apresentam, conforme Rochon et al. (2004), um ciclo de vida que envolve a produção de zoosporângios, dos quais contém zoósporos, que permite a dispersão a uma longa distância, junto com a produção de esporos de resistência que ajudam na sobrevivência do fungo durante vários anos. Os zoósporos de O. bornovanus, e 24 O. brassicae podem ser diferenciados pelo seu tamanho. (LANGE e INSUNZA, 1977). Por outro lado, conforme Herrera - Vásquez et al. (2007) os zoosporângios são muito similares e não permitem uma diferenciação com absoluta certeza através de características morfológicas. Quanto aos esporos de resistência, morfologicamente o O. bornovanus, apresenta uma aparência de favos de abelha, enquanto o O. brassicae em forma estrelada. Quanto a sua classificação O. bornovanus apresenta-se em dois distintos grupos: um polífago e o outro de ataque às Cucurbitáceas. (LANGE e INSUNZA, 1977; CAMPBELL e SIM, 1994). Já O. Brassicae é heterotálico e afetam as crucíferas, enquanto O. virulentus são espécies homotálicas e não afetam as crucíferas. Mochizuki et al. (2008) concluíram que a espécie O. virulentus não transmite o MNSV, fato esse explicado pela não detecção da partícula do MNSV na superfície do zoósporo do O. virulentus. No entanto, ao contrário do observado no estudo realizado por estes últimos autores, Herrera - Vásquez et al. (2009) detectaram em seus estudos a presença do MNSV nas espécies de O. virulentus. Ainda, foi observada a presença do fungo O. bornovanus nas raízes das plantas amostrais de melão, oriundas do Brasil. Entretanto, não foi observada a presença do vírus MNSV nessas plantas. Como documentado por vários autores, dentre esses Herrera - Vásquez et al. (2007), Olpidium bornovanus é um vetor potencial do MNSV. Stanghellini et al. (2010) trabalhando com plantas de melão cantaloupe em cultivo hidropônico, através de inoculação, verificaram que esse fungo é capaz de ocasionar escurecimento e redução no crescimento da raiz. Inicialmente, o gênero Olpidium estava enquadrado na ordem Spizellomycetale, do filo Chytridiomycota (quítridos). (BARR, 1980). Mas, atualmente, essa classificação é objeto de várias discussões. (BARR, 2001). 2.7 MARCADORES GENES ESPECÍFICOS UTILIZADOS NA DETECÇÃO DE FITOPATÓGENOS E VETORES DE DOENÇA 25 A partir da década de 1960 várias técnicas moleculares foram disponibilizadas para a detecção e identificação de vírus, bactérias, nematoides e fungos patogênicos de plantas cultivadas. (ARRIEL et al., 2009). Porém, com o surgimento da PCR (Reação de Cadeia em Polimerase), na década de 80, tornou-se possível analisar com mais precisão o DNA dos indivíduos, e desse modo, determinar pontos de interesse no cromossomo dos mesmos. Tais técnicas permitiram um estudo mais complexo de características de importância ligadas aos fatores genéticos, por analisar regiões especificas do genoma. Ao contrário da maioria das classes de marcadores moleculares atualmente disponíveis, as quais detectam diferenças entre indivíduos com base no DNA de modo aleatório, uma classe de marcadores tem merecido grande destaque. Tais marcadores são conhecidos como marcadores genes específicos e se caracterizam por estarem ligados a regiões gênicas específicas da espécie em estudo. Com a sintetização dos oligonucleotídeos para a amplificação de sequência específica no genoma dos indivíduos, utilizando-se da técnica da PCR, muitos estudos têm sido realizados para a detecção de patógenos. Dentre esses, como citam Crouch et al. (1998) os primers utilizados para a detecção de BSV (Banana Streak Virus). Pois esses primers são desenvolvidos com base nas regiões altamente conservadas, denominadas ITS (internal transcrib spacer). A aplicação dos marcadores moleculares utilizando primers genes específicos tem revelado ser uma importante ferramenta no estudo de indivíduos de diferentes espécies. Pois a versatilidade e sensibilidade da PCR proporcionam diversas alternativas ao uso de marcadores moleculares e a possibilidade de se comparar regiões do DNA genômico das sequências conservadas nos indivíduos. (ARRIEL et al., 2009). Segundo Martin et al. (2000) a técnica da PCR tem sido utilizada predominantemente para a detecção de patógenos, fazendo o uso dos primers genes específicos. De acordo com Destéfano (2003) primers específicos tem sido desenvolvido para a detecção e identificação de fungos entomopatogênicos como Beauveria bassiana, Gliocladium catenulatum e Metarhizium anisopliae. Esse mesmo autor, também identificou através de primers genes específicos 26 Metarhizium anisopliae em larvas de Diatraea saccharalis. Silva (2008) trabalhou com a técnica da RT-PCR utilizando primers genes específicos para a identificação de estirpes de Complexo Potato vírus Y (PVY) em plantas de batata. Maes et al. (1996) desenharam primers genes específicos para diferenciação de Xanthomonas, uma bactéria fitopatogênica que causa estrias foliares em cereais. De acordo com Loreti e Gallelli (2001) o desenvolvimento de primers específicos para a detecção e identificação de patógenos tem sido reportado para um grande número de bactérias fitopatogênicas. Sellés et al. (2004) identificaram Pepino mosaic vírus (PepMV) através de primers genes específicos em plantas daninhas na Espanha. De acordo com esses autores, essas descobertas revelam fontes potenciais de vírus e contribuiem para uma maior compreensão da epidemiologia do PepMV na Espanha. Herreira - Váquez et al. (2009) utilizaram primers genes especificos para a identificação de fungos do gênero Olpidium e do MNSV em plantas de melão. Também foi realizado um trabalho com fungos do gênero Phythophora, com primers genes específicos. (BELBARHRT et al., 2005). 27 REFERÊNCIAS ARAÚJO, J. L. P.; VILELA, M. J. Aspectos socioeconômicos. In: SILVA, H. R. da; COSTA, N. D. (Ed). Melão: Produção Aspectos técnicos. Brasília: Embrapa Informação Tecnológica, 2003. p.15-18. ARAÚJO, L. G. 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As viroses têm como principal transmissor os fungos, dentre os quais podemos mencionar os que pertencem ao gênero Olpidium, que são fungos habitantes do solo e transmitem vírus a diversas espécies de plantas. Diante da importância econômica da cultura do melão para a região do Semi-Árido, é importante a realização de estudos que detectem precocemente a existência desses vetores. A presente pesquisa teve como objetivo identificar a presença de fungos do gênero Olpidium (O. bornovanus, O. brassicae e O. virulentus) por meio de análises microscópicas e moleculares em raízes de plantas de melão, cultivados em solos de áreas de produção nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará. As análises microscópicas foram realizadas em 275 raízes de plantas de melão. Essas raízes foram submetidas ao processo de clarificação e posteriormente analisadas, via microscópio óptico. Para as análises moleculares, foram extraídos DNA de três amostras de raízes de plantas cultivadas em solos de cada uma das áreas de cultivo. Os ensaios de PCR foram realizados utilizando-se primers genes específicos para as três espécies do gênero Olpidium. Os resultados morfológicos obtidos revelaram que das 275 raízes de plantas analisadas, 69,81% apresentaram esporos apenas do Olpidium bornovanus. Não foi observada nesta análise a presença de esporos do Olpidium brassicae e nem do Olpidium virulentus. De acordo com as análises moleculares das 10 fazendas, seis do RN e três do CE, foram positivas para a presença do fungo Olpidium bornovanus. Do mesmo modo, como observados pelas análises microscópicas, não foram confirmadas a presença do Olpidium brassicae e Olpidium virulentus nas análises moleculares. Portanto, conclui-se que os solos coletados nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará, têm a presença de indivíduos da espécie do Olpidium bornovanus e que estudos adicionais devem ser realizados para a confirmação da presença do vírus causador de doença na cultura do melão (Vírus da Mancha Necrótica do Melão) do qual este fungo é vetor transmissor. 34 Palavras-chaves: Cucumis melo L, fungo vetor, análise microscópica, análise molecular. 35 ABSTRACT MOURA, Maria da Conceição Freitas. Microscopic and molecular identificacion of Olpidium spp. in roots of Cucumis melo L. 2012. 72f. Dissertation (M. Sc. In Agronomy/Phytotechny) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2012. Viruses are pathogenic factors limiting the melon (Cucumis melo L) yield, and because of its large existing variety, the control becomes difficult. The viruses have the fungi as their main transmitter, among which is the Olpidium genus which are soil inhabiting fungi that transmit viruses to several species of plant. Face to the economic importance of the melon crop for the brasilian Semi-Arid region, it is important to conduct studies to early detect the existence of these vectors. This research aimed to identify the presence of fungi of the Olpidium (O. bornovanus, O. brassicae and O. virulentus) genus through microscopic and molecular analyzes in melon plant roots grown in production soils in the states of Rio Grande do Norte (RN) and Ceará (CE). The microscopic analyzes were performed in 275 melon roots. These roots were subjected to the clarification process and further analyzed through optical microscope. For molecular analysis, DNA were extracted samples from three plant roots grown in soil from each one of cultivation areas. The PCR assays were performed using specific primers genes from three species of Olpidium genus. The results obtained showed that from 275 roots morphologically analyzed, 69,81% showed only the spores of Olpidium bornovanus. It was not observed in this analysis the presence of spores from Olpidium brassicae and Olpidium virulentus. According with the molecular analysis from 10 farms, six ones in the state of RN and three ones in the state of CE were positive to the presence of Olpidium bornovanus fungus. Similarly, as observed through microscopic analysis, it was not confirmed the presence of Olpidium brassicae and Olpidium virulentus in the molecular analyzes. Therefore, it was concluded that the soils collected in the states of Rio Grande do Norte and Ceará have the presence of Olpidium bornovanus and that further studies should be conducted to confirm the presence of virus causing disease in the melon crop (Melon Necrotic Spot Virus) which this fungus is transmission vector. Key-words: Cucumis melo L, fungus vector, microscopic analyzes, molecular analyzes. 36 1 INTRODUÇÃO A cultura do melão no aspecto de produção mundial é uma hortícola de grande representatividade, sendo importante no mercado consumidor. Porém, a prática do monocultivo tem sido acompanhada de diversos problemas, como as doenças ocasionadas por fungos e vírus, repercutindo assim, em perdas significativas na produção e na economia. Os fatores fitopatogênicos limitantes a produção do melão (Cucumis melo L), são em especial os ocasionados pelos vírus, que em virtude da grande variedade existentes, se tornam difíceis o seu controle. As doenças viróticas na sua maioria têm como principal transmissor os fungos, dentre os quais podemos mencionar os que pertencem ao gênero Olpidium, estes são fungos habitantes do solo e considerados parasitas que atacam as raízes das plantas, tendo como principal importância transmitir vírus a diversas espécies hortícolas. (ROCHON et al., 2004; SASAYA e KOGANEZAWA, 2006). As espécies pertencentes ao gênero Olpidium transmissoras de viroses são O. bornovanus, O. brassicae e O. virulentus. Esses apresentam um ciclo de vida que envolve a produção de zoosporângios, os quais contêm os zoósporos, que permitem a dispersão do fungo a uma longa distância. Além disso, apresentam produção dos esporos de resistência que possibilita a sobrevivência do fungo por vários anos, constituindo assim, numa importante forma de disseminação. (ROCHON et al., 2004). Esses fungos apresentam ciclos de vida com fases assexuada e sexuada. Segundo Alexopoulos e Mims (1979) a fase assexuada do Olpidium inicia-se nas raízes da planta quando esta entra em contato com a água, havendo a liberação de zoósporos, os quais estavam contidos nos zoosporângios. A fase sexuada ocorre quando os zoósporos comportam-se como planogametos, originado de diferentes zoosporângios. A espécie O. bornovanus está presente em dois diferentes grupos: um polífago e outro restrito as Cucurbitáceas. (LANGE e INSUNZA, 1977; CAMPBELL e SIM, 1994). O O. brassicae são espécies heterotálicas que afetam 37 as Crucíferas e O. virulentus espécies homotálicas que não afetam as Crucíferas. (KOGANEZAWA et al., 2005). O Olpidium, como informa Barr (1980), antigamente estava enquadrado na ordem taxonômica Spizellomycetales, pertencente, portanto, ao filo quítridos (Chytridiomycota). Porém, essa classificação foi discutida em trabalhos posteriores. (BARR, 2001). Segundo James et al. (2006) o Olpidium brassicae não se enquadra em nenhuma ordem do filo Chytridiomycota, resultados estes obtidos através de estudos filogenéticos. Barr (2001) ainda menciona que a maioria dos Chytridiomycota vive em ambientes terrestres, semelhante ao habitat do Olpidium, que são fungos habitantes de solo. No que diz respeito às diferenças entre as espécies do gênero Olpidium, os zoósporos do Olpidium bornovanus e Olpidium brassicae podem ser diferenciados pelo seu tamanho e padrão de nado. (LANGE e INSUNZA, 1987). Mas, Herrera Vásquez (2009) cometa que essas características são inadequadas no diagnóstico de rotina. Por outro lado Herrera - Vásquez et al. (2007) informam que os zoosporângios dessas espécies são muito similares, e a melhor maneira de diferenciar esses fungos são através das características morfológicas dos esporos de resistência. Dessa forma, Campbell e Sim (1994) informam o aspecto morfológico dos esporos de resistência que diferenciam as espécies bornovanus e brassicae. Segundo esses autores, O. bornovanus possui parede exterior lisa, e a interior se assemelhando a favos de abelha, O. brassicae apresenta forma estrelada. E com relação a O. virulentus não pode ser diferenciado por análises morfológicas. (KOGANEZAWA et al., 2005). Sendo assim, uma alternativa para se confirmar com maior precisão a existência dessas espécies nas plantas seria através de análises moleculares, trabalhando com primers genes específicos, que amplificam sequências específicas do genoma da espécie em estudo. Acerca das discussões acima relacionadas às espécies de Olpidium, como hospedeiros e transmissores de doenças viróticas a espécies hortícolas, o presente trabalho teve como objetivo identificar a presença de fungos do gênero Olpidium (O. bornovanus, O. brassicae e O. virulentus) por meio de análises microscópicas e 38 moleculares em raízes de plantas de melão, cultivados em solos de áreas de produção nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará. 39 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 local do experimento Os experimentos foram conduzidos na casa de vegetação e no laboratório de Fitopatologia do Departamento de Ciências Vegetais da Universidade Federal Rural do Semi-Árido – UFERSA, localizado no município de Mossoró - RN, situado a 05º 11’ 15” de latitude Sul e 37º 20’ 39” de longitude Oeste, com uma altitude de 16 metros. 2.2 Amostragem do Solo Foi coletado um total de 55 amostras de solos em fazendas localizadas nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará, durante os meses de outubro a novembro de 2011. As áreas de coleta das amostras do agropólo Mossoró/ Assú – RN foram nas sete seguintes fazendas: WG sede, cujas coordenadas geográficas são: 05° 06' 41,74" de latitude Sul e 37° 39' 4,12" de latitude Oeste, WG Sumidouro (05º 06’ 34,19” S e 37º 39’ 46,29” W), WA (05º 06’ 21,39” S e 37º 40’ 49,47” W), Frutavida (04º 59’ 28,7” S e 37º 23’ 31,7” W), Dinamarca (04º 54’ 25,7” S e 37º 24’ 4,7” W), Norfruit (04º 54’ 9,4” S e 37º 21’ 59,9” W) e Brasil Melon (04º 54’ 28,8” S e 37º 22’ 35,9” W). Na do Baixo Jaguaribe foram às fazendas: Agrícola Famosa (04º 52’ 4,13” S e 37º 20’ 16,94” W), Palmares I e II (94º 56’ 69, 8” S e 67º 50’ 75” W) e RBR (04º 51’ 31” S e 37º 26’ 42” W). Em cada fazenda foram coletadas cinco amostras de solo. Somente na fazenda Palmares a coleta dos solos foram em duas áreas distintas. Após a coleta, os solos foram trazidos para o laboratório de Fitopatologia da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA) Mossoró - RN, colocados em bandejas de plásticos, cobertas com papel toalha para evitar a contaminação e expostas ao ar livre por uma semana. Após a secagem, essas amostras de solo foram peneiradas em peneira de 2 mm, e posteriormente 40 utilizadas para detectar a presença do Olpidium spp através das raízes das plantas de melão que foram cultivadas nesses solos. 2.3 Preparo das Amostras As sementes de melão tipo Amarelo (variedade Goldex) passaram por um tratamento a uma temperatura de 70 ºC, durante 144h, essa recomendação foi de acordo com Herrera - Vásquez et al. (2009). As condições do fotoperíodo em que as sementes ficaram foram de 24 horas (noite) e a umidade relativa de aproximadamente 15%. A finalidade desse tratamento foi eliminar a presença de vírus nas sementes utilizadas, em especial o Vírus da Mancha Necrótica do Melão. Após feito esse tratamento, estas sementes foram colocadas para germinar numa placa de petri, com papel filtro e irrigadas com água destilada e autoclavada. O transplantio foi realizado após as plântulas emitirem a radícula. Para tanto foram colocadas em um copo de 500 ml, no qual continha a mistura do solo coletado nas fazendas, mais a areia autoclavada na proporção de 1:10. Posteriormente esses copos foram levados para a casa de vegetação, a qual apresentava temperatura variando de 25 ºC a 30 ºC e umidade relativa de 60%. Como controle negativo, o mesmo procedimento foi feito com os copos das plantas cultivadas em solos totalmente autoclavados (sem a presença do Olpidium spp). O experimento foi feito em delineamento inteiramente casualizado com cinco repetições cada, totalizando 25 amostras de plantas analisadas por fazenda. Trinta dias após o transplantio, as plantas foram removidas cuidadosamente para não danificar o sistema radicular e realizadas as análises seguintes. 2.4 Análise microscópica do Olpiduim ssp. Depois de colhidas, as raízes das plantas foram avaliadas microscopicamente seguindo o método de Jordá et al. (2002). Este método consistiu na lavagem das raízes com água corrente para a retirada dos nódulos de terra aderidos as mesmas. Seguida a lavagem, as raízes foram colocadas em banho 41 de potássio a 10% por um período de 24 horas. Após esse período, as raízes foram lavadas com água destilada duas vezes e colocadas imersas no HCl (ácido clorídrico) a 10% durante 10 minutos para a neutralização total do Potássio. E outra vez, foi feita a lavagem com água destilada (duas vezes) para a retirada do HCl, e então as raízes estavam prontas para as análises microscópicas. Os segmentos das raízes de cada planta foram colocados em lâminas e corados com azul de bromofenol. Em seguida as análises microscópicas foram feitas em microscópico óptico (Olympus CX 31) na resolução 40x e registrados através de fotografias. As características observadas para a identificação e diferenciação das espécies de Olpidium foram o formato da parede externa dupla, presente nos esporos de resistência e a semelhança desses, com favos de abelha (O. bornovanus) e forma estrelada (O. brassicae). 2.5 Análise molecular do Olpiduim ssp. A primeira etapa da análise molecular consistiu na extração do DNA das espécies de Olpidium, utilizando três amostras de plantas, cultivadas em solos de cada fazenda. Essas raízes haviam sido identificadas pela análise microscópica como positivas para a presença de Olpidium. Aproximadamente 0,06g das amostras de raízes foram maceradas em nitrogênio liquido e a extração do DNA do Olpidium spp foi realizada pelo kit (Invisorb Spin Plant Mini Kit) seguindo as instruções do fabricante. Após a extração do DNA, 5µL de cada amostra foi submetida à quantificação em gel de agarose a 1%, corados com brometo de etídio e fotodocumentado sob luz ultra-violeta. As análises de PCR foram realizadas utilizando-se primers genes específicos do O. bornovanus, brassicae e virulentus (Tabela 1). As condições de reação seguiram o protocolo de Herreira-Vasquez et al. (2009), que trabalhou com um volume total de 50 L, contendo Tris-HCl 10 mM (pH 8,3) , KCl 50 mM MgCl2 2,0 mM, 0,4 mM de cada dNTP, 0,2 mM de cada um 42 dos primers genes específicos, 5 U de Taq DNA polimerase (Biotec) e, aproximadamente 50 ng de DNA. As amplificações do DNA foram realizadas em termociclador (PTC-100TM Programmable Thermal Controller) de acordo com o seguinte programa: 94ºC por 5 min + 35 ciclos de 94ºC a 45s, 45 °C a 1 min, 72 °C por 1 min + 72 °C por 10 min e redução a 15 °C. Os produtos de PCR foram separados em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio e fotografados sob luz ultra-violeta. O tamanho dos fragmentos foi determinado comparando com o marcador λ DNA/ Hind III de 125 pb (Invitrogen). Tabela 1 - Sequência dos primers genes específicos do Olpidium bornovanus, O. brassicae e O. virulentus. Espécies Nome Sequência (5’ – 3’) Tamanho do dos primer fragmentos esperados O.bornovanus OLPborF O.virulentus O.brassicae CCGAGGAAATGAGAGAGATGACA OLPborR TCCTCCGCTTATTGATATGCTTA OLPvirF AACCGAAGACCTGCCCCCAAAAG OLPvirR TCCTCCGCTTATTGATATGCTTA OLPbraF AGCTATAGCTCACCCTCTTT OLPbraR TCCTCCGGCTTATTGATATGCTTA Fonte: Herrera - Vásquez et al. (2009). 43 977pb 579pb 204pb 3 RESULTADO E DISCUSSÃO 3.1 Identificação microscópica e molecular do Olpidium bornovanus em amostras de plantas cultivadas em solos do Estado do Rio Grande do Norte Ao analisar microscopicamente as 175 raízes de plantas de Cucumis melo cultivadas em solos coletados em sete fazendas pertencentes ao Estado do Rio Grande Norte, 73,14% foram positivas apenas para o Olpidium bornovanus. Nenhuma das raízes cultivadas em solos oriundos do Estado do Rio Grande do Norte tinham a presença do O. virulentus e O. brassicae. Esses dados foram confirmados por Herrera - Vásquez et al. (2009), que não identificaram essas espécies de fungos quando analisaram 4 plantas cultivadas em solo originados do Brasil. Porém, vale ressaltar que todas as fazendas tiveram pelo menos três amostras de solos positivas para a presença do O. bornovanus. Dessa forma, os dados gerados no presente estudo estão de acordo com os observados por Herrera - Vásquez et al. (2009), o qual, através de estudos morfológicos com solos coletados no Brasil, identificaram espécies de Olpidium em três das quatros plantas avaliadas. Nas análises microscópicas realizadas com as raízes cultivadas nos solos originados das fazendas WA e Brasil Melon, observou-se que todas as amostras tinham a presença do O. bornovanus (Figura 1), no entanto, comparando com os dados moleculares, somente a amostra 13 pertencente à fazenda WA (Figura 2) e as amostras 32 e 33 dos solos coletados na fazenda Brasil Melon, amplificaram o fragmento de DNA esperado para o O. bornovanus, confirmando assim, a presença do mesmo, a nível molecular (Figura 3). Observou-se que algumas raízes apresentaram quantidade pequena de esporos de resistência do O. bornovanus, e isso pode explicar, a não amplificação por completo a nível molecular de todas as amostras utilizadas no estudo. 44 Figura 1: Porcentagem de raízes de meloeiro (Cucumis melo L) infectadas por esporos de resistência de Olpidium bornovanus, cultivados em solos que foram coletados em fazendas localizadas no Estado do Rio Grande do Norte. WA - Fazenda WA; BM – Fazenda Brasil Melon; WG sede – Fazenda WG sede; D – Fazenda Dinamarca; F – Fazenda Frutavida; N- Fazenda Norfruit; WG sum – Fazenda WG sumidouro II. 977pb Figura 2: Amostras de fragmentos de DNA extraídos de raízes de Cucumis melo L amplificados com primers genes específicos de Olpidium bornovanus. M – marcador de peso molecular. 45 977pb Figura 3: Amostras de fragmentos de DNA extraídos de raízes de Cucumis melo L amplificados com primers genes específicos de Olpidium bornovanus. M – marcador de peso molecular. Das plantas avaliadas na fazenda WG sede, observou-se que 88% das raízes estavam infectadas pelo fungo O. bornovanus, sendo essa identificação confirmada através de análise molecular. A amostra 1 (Figura 2), quando analisada moleculamente, foi a única a ser confirmada para a presença do referido fungo. Os estudos microscópicos feitos com as amostras de raízes de plantas cultivadas nos solos pertencentes à fazenda Dinamarca, verificou-se que 84% dessas raízes estavam infectadas com esporos de resistência do O. bornovanus. Por outro lado apenas a amostra 22 (Figura 3) foi confirmada para a presença do O. bornovanus mediante estudo molecular. Nas análises das raízes de plantas cultivadas em solos pertencentes às fazendas Frutavida e Norfruit, verificou-se que 52% dessas raízes tinham a presença do O. bornovanus e a amostra 19 (Figura 2), pertencente à fazenda Frutavida, quando analisada moleculamente, foi confirmada a presença desse fungo. Também foram confirmadas a presença molecular do O. bornovanus nas amostras 27 e 28 (Figura 3) dos solos coletados na fazenda Norfruit. Esporos de resistência do O. bornovanus foram também identificados na fazenda WG sumidouro II, mas não foi possível confirmar essa presença nos estudos moleculares. Herrera - vásquez et al. (2009), ao observarem 46 microscopicamente segmentos de raízes de plantas de pepino na Espanha, identificaram espécies de O. bornovanus nas plantas avaliadas. Diversos autores entre eles Dias (1970); Tomlinson e Thomas (1986); Goméz et al. (1993); Campbell et al. (1996), têm discutido a relação da capacidade de conservação do fungo O. bornovanus no solo e nas raízes de plantas cultivadas, durante um grande período de tempo. Em estudos feitos por Guirado et al. (2009) com a finalidade de estudar a conservação do O. bornovanus, verificaram a presença do referido fungo em amostras de solo secas durante vários anos. Aguilar et al. (2010) ao realizarem um estudo avaliando a eficiência da compostagem de resíduos de plantas infectadas com vírus e a interferência desta, em reduzir a ocorrência do Pepper Mild Mottle Vírus (PMMV) em pimenta, do Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV) e o Olpidium bornovanus em melão, constataram que nas plantas de melão cultivadas com os extratos dos resíduos das plantas infectadas, o fungo O. bornovanus permaneceu viável nessas raízes até 240 dias. Guirado et al. (2009), ao estudarem vários isolados do O. bornovanus inoculados em várias plantas pertencentes a diversas espécies botânicas, dentre elas, a Lactuca sativa L, identificaram que somente as plantas pertencentes a família das Cucurbitáceas (C. melo, C. sativus, C. lanatus, L. siceraria, C. ficifolia, C. máxima e C. pepo) foram colonizadas por alguns desses isolados do O. bornovanus. 3.2 Identificação microscópica e molecular do Olpidium bornovanus em amostras de plantas cultivadas em solos do Estado do Ceará Aos observar microscopicamente as 100 plantas cultivadas em solos coletados no Estado do Ceará, verificou-se que 64% das amostras de raízes analisadas de C. melo, estavam infectadas somente com esporos de resistência do O. bornovanus. Assim como não haviam sido identificados à presença do O. virulentus e do O. brassicae no Estado do Rio Grande do Norte, também não foram 47 detectadas a presença dos referidos fungos nas raízes das plantas cultivadas nos solos coletados no Estado do Ceará. Figura 4: Porcentagem de raízes de meloeiro infectadas por esporos de resistência de Olpidium bornovanus, cultivadas em solos que foram coletados em fazendas localizadas no Estado do Ceará. Pal. I e II - Fazenda Palmares; A. Famosa – Fazenda Agrícola Famosa; RBR – Fazenda RBR. Com base nos resultados observados na figura 4, pôde-se verificar que na fazenda Palmares (área I e II), foi identificado à presença de esporos de resistência de O. bornovanus, através de estudos microscópico em 76% e 64% das raízes, respectivamente. De acordo com as análises moleculares realizadas com as plantas cultivadas nas amostras 38 e 39 da área da fazenda Palmares I (Figura 3) e a amostra 41 da Palmares II (Figura 5) foram positivas para a presença do O. bornovanus. 48 977pb Figura 5: Amostras de fragmentos de DNA extraídos de raízes de Cucumis melo L amplificados com primers genes específicos de Olpidium bornovanus. M - marcador de peso molecular. A fazenda Agrícola Famosa apresentou 60% de raízes infectadas por O. bornovanus (Figura 4). A sua identificação também aconteceu em nível molecular, através da amostra 47 (Figura 5). Verificou-se que a fazenda RBR, foi a que apresentou os menores índices de detecção do O. bornovanus, onde 56% das raízes apresentaram esporos de resistência do referido fungo (Figura 4), e a amostra 53 (Figura 5), confirmou essa identificação quando feito o estudo molecular. A Figura 6 mostra segmentos de raiz de Cucumis melo que foi cultivada em solo pertencente ao Estado do Ceará e que está infectada com fungo O. bornovanus. 49 Figura 6: Esporos de resistência do Olpidium bornovanus em raízes de meloeiro cultivadas em solos pertencentes à fazenda Agrícola Famosa – Icapuí/CE. Segundo Campbell e Sim (1994) a morfologia dos esporos de resistência desses fungos é reconhecida como uma importante característica morfológica que diferencia essas espécies (O. bornovanus e O. brassicae). A identificação morfológica é o inicio para um estudo mais aprofundado dessas espécies de fungo, em razão da sua desvantagem em transmitir vírus às espécies de plantas, como o melão, que é uma cultura de grande importância econômica para a região Nordeste. Stanghellini et al. (2010) informam que esses fungos não somente são vetores de doenças viróticas, mas podem ser capazes de causar escurecimento significativo da raiz e redução no crescimento da mesma, resultado este, obtido aos 28 dias, trabalhando com melão cantaloupe. Espécies de O. bornovanus também foram identificadas morfologicamente em plantas de melão no Panamá. (HERRERA - VÁSQUEZ et al., 2009). Os mesmos autores, também confirmaram a presença dos referidos fungos quando feito o estudo pela técnica multiplex PCR, utilizando primers genes específicos. Plantas cultivadas em solos de produção de melancia na Espanha apresentaram O. bornovanus em 12 das 28 plantas analisadas. A presença de O. bornovanus em solos de cultivo de melancia, também foi identificado na Guatemala, em Honduras, no México e Uruguai. 50 De acordo com Stanghellini e Misaghi (2011), o O. bornovanus, também está envolvido diretamente na indução da germinação de ascósporos do fungo Monosporascus cannonballus Pollack & Uecker. Uma vez que este fungo (Monosporascus cannonballus) é de grande preocupação para os produtores de Cucurbitáceas da região do Semi-Árido brasileiro, e constitui um sério problema nos campos de cultivo. Cara et al. (2008) ao trabalharem com a cultivar de melão amarelo canário, cultivada em solos contaminados, identificaram morfologicamente a presença do O. bornovanus na Guatemala. Segundo esses autores, o fungo O. bornovanus coloniza as raízes de melão em menos de uma semana, além disso, esses patógenos associados com o MNSV (Vírus da Mancha Necrótica do Melão) estão envolvidos com a doença do declínio da videira do melão neste país. A identificação desses fungos precocemente possibilita que medidas preventivas sejam feitas, uma vez que, a presença desses vetores nos campos de produção constitui um sério problema, em virtude de serem transmissores de viroses às diversas espécies hortícolas. Porém, verifica-se que as espécies pertencentes à família das Cucurbitáceas, têm sido as mais afetadas. 51 4 CONCLUSÃO Os solos coletados nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará tem a presença do fungo Olpidium bornovanus. Estudos adicionais são necessários para verificar se há o Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV), causador de doença na cultura do meloeiro, do qual este fungo é vetor transmissor. 52 REFERÊNCIAS AGUILAR, M.I. et al. Efficacy of composting infected plant residues in reducing the viability of Pepper mild mottle virus, Melon necrotic spot virus and its vector, the soil-borne fungus Olpidium bornovanus. Crop Protection, v. 29, p. 342-348, 2010. ALEXOPOULOS, C.J.; MIMS, C.W. Introductory Mycology. 3 ed. New York: USA, 1979. 632p. BARR, D.J.S. An outline for the reclassification of the Chytridiales, and for a new order, the Spizellomycetales. Canadian Journal of Botany, v. 58, p. 2380–2394, 1980. BARR, D.J.S. Chytridiomycota. 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Annals of Applied Biology, v. 108, p. 71–80, 1986. 55 CAPÍTULO 3 IDENTIFICAÇÃO DO VÍRUS DA MANCHA NECRÓTICA DO MELÃO (MNSV) POR ANÁLISE MOLECULAR EM RAÍZES DE MELOEIRO RESUMO MOURA, Maria da Conceição Freitas. Identificação do Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV) por análise molecular em raízes de meloeiro. 2012. 72f. Dissertação (Mestrado em Agronomia: Fitotecnia) - Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2012. O Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV) também conhecido como causador da doença calapso do melão é um vírus endêmico e de grande virulência que vem causando severas destruições nas áreas de cultivo, atacando principalmente espécies de Cucurbitáceas, como o melão (Cucumis melo L), pepino (Cucumis sativus L) e a melancia (Citrullus lanatus). A sua transmissão pode ocorrer de forma mecânica, através do contato entre folhas, por insetos, pela semente e por fungos do gênero Olpidium. Estes vírus causam necrose nas folhas, estrias no talo da planta, e em algumas ocasiões podem afetar os frutos, além de ocasionar o murchamente súbito na planta, provocando a morte da mesma. O presente trabalho teve como objetivo, verificar por análises moleculares, a presença do Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV) em raízes de Cucumis melo L, cultivados em solos provenientes de áreas produtoras dos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará. Os estudos referentes à parte molecular foram realizados a partir da extração do RNA de três amostras de raízes de plantas cultivadas em solos de cada área de coleta. Posteriormente, o RNA foi convertido em cDNA por meio da técnica RT-PCR. Amostras do cDNA obtidos foram amplificados via PCR, utilizando-se primers genes específicos do MNSV. De acordo com os resultados, foi possível detectar a presença do Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV) em três das 10 fazendas analisadas. Dessa forma, concluímos que o MNSV está presente nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará e que medidas de controle devem ser realizadas para evitar o alastre dessa doença em novas áreas, minimizando assim, as perdas econômicas ocasionadas aos produtores, em virtude da virulência apresentada por esses vírus nos campos de produção. Palavras-chaves: Cucumis melo L, análise molecular, MNSV. 56 ABSTRACT MOURA, Maria da Conceição Freitas. Identification of Melon Necrotic Spot Virus (MNSV) through molecular analyzes in roots of melon plants. 2012. 72f. Dissertation (M. Sc. In Agronomy/Phytotechny) – Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA), Mossoró-RN, 2012. The Melon Necrotic Spot Virus (MNSV), well known for causing melon collapse disease, is an endemic virus and of high virulence that has caused severe damage in the growing areas, attacking mainly Cucurbitaceae species such as melon (Cucumis melo L), cucumber (Cucumis sativus) and watermelon (Citrullus lanatus). The transmission may be mechanical, through contact among leaves, through insects, seed or fungi of the Olpidium genus. These viruses cause necrosis in leaves, streaks in the stalk of the plant, and sometimes they can affect the fruit. In addition they can cause the sudden wilting on the plant and the death. This study aimed to identify through molecular analyzes, the Melon Necrotic Spot Virus (MNSV) in roots of Cucumis melo L, grown in soils from producing areas the states of Rio Grande do Norte and Ceará. The molecular analyzes were made from RNA extracted of three roots of plants grown in soils of each collection area. Subsequently, the RNA was converted to cDNA through RT-PCR. Samples of the cDNA obtained were amplified through PCR using MNSV specific primers genes. According to the results obtained, it was possible to detect the presence of the Melon Necrotic Spot Virus (MNSV) in three of the 10 farms analyzed. Thus, we conclude that the MNSV is present in the states of Rio Grande do Norte and Ceará and that control measures should be taken to avoid spreading the disease to new areas, minimizing the economic losses caused to producers by virulence presented by these viruses in the fields. Key-words: Cucumis melo L, molecular analyzes, MNSV. 57 1 INTRODUÇÃO A região Nordeste, em especial os Estados do Ceará e Rio Grande do Norte, tem grande expressão econômica no Brasil, onde juntos destacam-se com 98,38% da produção e comercialização do melão (Cucumis melo L), gerando emprego e renda à população do Semi-Árido brasileiro. Além disso, destaca-se ainda em nível de mercado internacional, com a exportação desses frutos principalmente para o continente europeu, aumentando assim, a economia do país. Em razão de diversos ataques à cultura do melão por patógenos e que em muitos casos tem ocorrido à destruição por completo das áreas de cultivo, produtores dessa cultura tem sofrido com grandes perdas econômicas. Dentre os patógenos causadores de severa destruição nas áreas de produção, podemos mencionar os ataques ocasionados por doenças viróticas, que são difíceis de combater em virtude da grande diversidade existente e de não se ter produtos específicos para eliminar ou prevenir as plantas dos ataques ocasionados pelos vírus. O Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV) pertence à família Tombusviridae. (RIVIERE e ROCHON, 1990) e ao gênero Carmovirus. São vírus endêmicos que atacam espécies de melão, pepino e melancia, e a sua presença pode ser observada tanto em plantios protegidos como em campo. De acordo com Kishi (1966) o MNSV foi detectado pela primeira vez em 1966 no Japão, em cultivos realizados sobre condições controladas. Posteriormente esse vírus foi verificado em outros países, dentre eles podemos mencionar os Estados Unidos. (GONZALEZ - GARZA et al., 1979). Segundo Lovisolo et al. (1982) a França. Bos et al. (1984) identificaram na Holanda. Avgelis (1985) na Grécia. Ryden e Persson (1986) na Suécia e no Reino Unido por Tomlinson e Thomas (1986). Também se detectou a presença do MNSV na Espanha segundo Martínez de Salinas et al. (1987). Na Noruega como informam Blystad e Nes (1995). Na Itália de acordo com Tomassoli et al. (1999). Na Côrrea como é relatado por Gug Seoun et al. (2003). Guatemala como informam Jordá et al. (2005). No Panamá em 58 2005. (HERRERA - VÁSQUEZ et al., 2006) e no Uruguai em 2009. (HERRERA - VÁSQUEZ, 2009). De acordo com Blancard et al. (1991) a transmissão do MNSV pode acontecer de forma mecânica, através do contato de uma folha com outra, por insetos da espécies Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata e D.balteata. (COUDRIET et al., 1979), pelos fungos vetores como o Olpidium bornovanus, O.brassicae e O.virulentus. (LANGE e INSUNZA, 1977; CAMPBELL e SIM, 1994) e pela semente. Porém como informa Campbell et al. (1996), a sua extensão aumenta quando se tem a presença do fungo. De acordo com Herrera - Vásquez et al. (2009) as mais importantes formas de disseminação são pelo fungo do filo quítridos e pela semente. O MNSV apresenta partículas isoméricas de aproximadamente 30nm de diâmetro e seu genoma é formado por um filamento de RNA com 4300 nucleótidos. (RIVIERE e ROCHON, 1990). Nesse filamento há regiões especificas, e cada uma exerce função importante quando o vírus esta dentro da planta, foi a partir dessas regiões que sintetizaram os primers específicos para a sua identificação. A região que expressa a proteína p7A/p7B é responsável pelo movimento do vírus dentro da planta, a proteína p29/p89 está relacionada a replicação do vírus dentro da planta e a p42 ou CP pela formação da capsula viral. Esse vírus é também conhecido como vírus do crivado ou vírus do colapso do meloeiro, sua sintomatologia é similar tanto em plantas de melão como as de pepino. Segundo Jordá (1997), esses sintomas consistem em pequenas manchas cloróticas nas folhas, evoluindo para necrose e posteriormente para o crivado. Estas manchas variam de 0,5 a 2,0 mm, podendo se estender e evoluir para grandes zonas. (LUIS - ARTEAGA, 1991; CUADRADO et al., 1993). De acordo com Cuadrado et al. (1993), ainda podem ser observados sintomas, como necrose nas folhas inferiores e intermediárias. Aparecem também estrias necróticas no colo e talo das plantas, nos pecíolos das folhas e nos pedúnculos dos frutos. Uma necrose marrom pode aparecer na base do talo, afetando somente a epiderme, podendo provocar a morte da planta por desidratação. (CUADRADO et al.,1993). 59 Geralmente os frutos de plantas atacadas por este vírus não são afetados. Em algumas ocasiões pode-se notar na casca um aspecto rugoso e cortíceo, e a polpa pode apresentar uma coloração marmoreada. (HERRERA - VASQUEZ, 2009). Outra manifestação frequentemente vista é o murchamento súbito, ocasionando a morte da planta. O interessante é que esses sintomas aparecem independente um do outro, ou podem estar juntos na mesma planta. Com relação ao aparecimento desses sintomas, Cuadrado et al. (1993) informam que os mesmos podem aparecer durante a maturação e a colheita dos primeiros frutos, embora algumas vezes, esses sintomas se manifestem antes desses estágios. Estas sintomatologias como também a sua severidade em atacar as plantas em especial à família das Cucurbitáceas, tem causado grandes perdas econômicas em diversos países, reduzindo dessa forma as áreas de produção, em virtude do ataque endêmico desse Vírus. As identificações a nível molecular de vírus, através de primers genes específicos, têm sido utilizados com êxito por diversos pesquisadores, entre eles, Herreira - Vasquéz et al. (2009), que identificaram a presença do MNSV em plantas de melão. Segundo Arriel et al. (2009) em razão dos genomas da maioria dos vírus serem constituídos de RNA, o uso da transcriptase reversa pela técnica de PCR, usando o cDNA, facilita a detecção de viroses em plantas. Essa técnica tornou-se uma ferramenta amplamente utilizada em estudos que envolvem um grande número de organismos vivos. (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1996). O objetivo desse estudo foi verificar através de análises moleculares, a presença do Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV) em raízes de Cucumis melo L, cultivados em solos provenientes de áreas produtoras dos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará. 60 2 MATERIAL E MÉTODOS 2.1 Local do experimento Os experimentos foram conduzidos na casa de vegetação e no laboratório de Fitopatologia do Departamento de Ciências Vegetais da Universidade Federal Rural do Semi-Árido – UFERSA, localizado no município de Mossoró - RN, situado a 05º11’15” de latitude Sul e 37º20’39” de longitude Oeste, com uma altitude de 16 metros. 2.2 Coleta e preparo das amostras Um total de 55 amostras de solos foram coletados em fazendas localizadas nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará, durante os meses de outubro a novembro de 2011. As áreas de coleta das amostras do agropólo Mossoró/ Assú – RN foram nas sete seguintes fazendas: WG sede, cujas coordenadas geográficas são: 05° 06' 41,74" de latitude Sul e 37° 39' 4,12" de latitude Oeste, WG Sumidouro (05 º06’ 34,19” S e 37º 39’ 46,29” W), WA (05º 06’ 21,39” S e 37º 40’ 49,47” W), Frutavida (04º 59’ 28,7” S e 37º 23’ 31,7” W), Dinamarca (04º 54’ 25,7” S e 37º 24’ 4,7” W), Norfruit (04º 54’ 9,4” S e 37º 21’ 59,9” W) e Brasil Melon (04º 54’ 28,8” S e 37º 22’ 35,9” W). Na do Baixo Jaguaribe foram às fazendas: Agrícola Famosa (04º 52’ 4,13” S e 37º 26’ 42” W), Palmares I e II (94º 56’ 69,8” S e 67º 50’ 75” W) e RBR (04º 51’ 31” S e 37º 26’ 42” W). Em cada fazenda foram coletadas cinco amostras de solo. Somente na fazenda Palmares a coleta dos solos foram em duas áreas distintas. Após a coleta, os solos foram trazidos para o laboratório de Fitopatologia da Universidade Federal Rural do Semi-Árido (UFERSA) Mossoró - RN, colocados em bandejas de plásticos, cobertas com papel toalha para evitar a contaminação e expostas ao ar livre por uma semana. Após a secagem, essas amostras de solo foram peneiradas em peneira de 2 mm, e posteriormente 61 utilizadas para detectar a presença do Olpidium spp através das raízes das plantas de melão que foram cultivadas nesses solos. As sementes de melão tipo Amarelo (variedade Goldex) passaram por um tratamento a uma temperatura de 70 ºC, durante 144h, essa recomendação foi de acordo com Herrera - Vásquez et al. (2009). As condições do fotoperíodo em que as sementes ficaram foram de 24 horas (noite) e a umidade relativa de aproximadamente 15%. A finalidade desse tratamento foi eliminar a presença de vírus nas sementes utilizadas, em especial o Vírus da Mancha Necrótica do Melão. Após a realização desse tratamento, estas sementes foram colocadas para germinar numa placa de petri, com papel filtro e irrigadas com água destilada e autoclavada. O transplantio foi realizado após as plântulas emitirem a radícula. Para tanto foram colocadas em um copo de 500 ml, no qual continha a mistura do solo coletado nas fazendas, mais a areia autoclavada na proporção de 1:10. Posteriormente esses copos foram levados para a casa de vegetação, a qual apresentava temperatura variando de 25ºc a 30ºc e umidade relativa de 60%. Como controle negativo, o mesmo procedimento foi feito com os copos das plantas cultivadas em solos totalmente autoclavados (sem a presença do Olpidium spp). O experimento foi feito em delineamento inteiramente casualizado com cinco repetições cada, totalizando 25 amostras de plantas analisadas por fazenda. Trinta dias após o transplantio, as plantas foram removidas cuidadosamente para não danificar o sistema radicular e realizadas as análises moleculares para a identificação do Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV). 2.3 Extração do RNA, RT-PCR e PCR com primers genes específicos A Extração do RNA foi realizada a partir de raízes de três diferentes plantas que foram cultivadas em amostras de solo de cada fazenda, totalizando 33 amostras de raízes analisadas. Aproximadamente 20 mg de raízes de cada uma das amostras foram maceradas em nitrogênio liquido e a extração do RNA foi realizada pelo kit ( Invisorb® Spin Virus RNA Mini Kit) seguindo as instruções do fabricante. 62 As amostras de RNA foram quantificadas em gel de agarose a 1% e corados com brometo de etídio. Para a síntese da molécula de cDNA, via RT-PCR, o volume total foi de 26 µl, contendo 5x first Strand buffer, 10mM de cada dNTP, 0,1M da DTT, 2,5 U da enzima M –MLV reverse transcriptase, 10µM de cada um dos três pares de primers (Tabela 2) e 100 ng do RNA. As amostras das reações permaneceram por 1 hora na temperatura a 42 ºC no termociclador (PTC-100TM Programmable Thermal Controller). Após a síntese do cDNA realizou-se a PCR utilizando primers genes específicos do MNSV (Tabela 2). As reações de amplificação foram feitas em um volume total de 25µL, contendo 10x buffer (200 mM Tris-HCL – pH 8,4; 500 mM (NH4)2 SO4), 10mM de cada dNTP, 10µM de cada um dos primers, 1U Taq DNA polimerase (Biotec) e o cDNA. As amplificações do cDNA com os primers genes específicos foram realizados no termociclador (PTC-100TM Programmable Thermal Controller) programado inicialmente para 2 minutos a temperatura de 94 ºC, seguido por 40 ciclos de desnaturação a 94 ºC por 15 segundos, anelamento a 40 ºC por 30 segundos, extensão a 72 ºC por 45 segundos e extensão final a 72 ºC por 10 minutos. Os produtos da PCR foram separados em gel de agarose a 1.5% e corados com brometo de etídio, TBE (tris base, ácido bórico e EDTA) a 80 v por 45 minutos. O tamanho dos fragmentos foi determinado comparando com o marcador 1 Kb Plus DNA Ladder de 100 pb (Invitrogen). 63 Tabela 2 - Sequência dos primers genes específico do Vírus da Mancha Necrótica do Melão (MNSV), baseado nas proteínas p29/28, p7A/p7B, p42. Localização Nome no genoma primer do Sequência (5’- 3’) Tamanho dos fragmentos esperados p29/89 p7A/p7B p42 MNSV5F AGGTTAGCAATGGATACTGG MNSV6R TCTCGTTTGATGTGGAAGAC MNSV3F CAGGGAAATCCTAGAATACAG MNSV4R ATTAATGCGTCTAACCATCG MNSV1F GGAGGCAACATTTCGTACA MNSV2R AGAGACCAAGCGATCAAAC Fonte: Herrera - Vásquez et al. (2009). 64 575pb 425pb 650pb 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO De acordo com os estudos realizados com os solos coletados no Estado do Rio Grande do Norte e Ceará, detectou-se a presença do MNSV (Vírus da Mancha Necrótica do Melão) em três das 10 fazendas analisadas. Os dados encontrados na presente pesquisa não estão de acordo com os de Herreira - vasquéz et al. (2009), que ao analisar solos pertencentes a campo de cultivo de melão no Brasil, não identificaram o MNSV nas raízes das plantas analisadas. Segundo estes autores, a não detecção do MNSV em raízes de plantas cultivadas em solos do Brasil, pode ter sido em virtude da quantidade pequena de amostras de raízes analisadas. As plantas avaliadas neste estudo para a detecção do MNSV foram coletadas no estágio inicial (30 dias após o transplantio) e por isso os sintomas não estavam suficientemente evidentes. As fazendas nas quais foram identificados o MNSV, através de primers genes específicos foram: a WA e a Norfruit (Figura 7), ambas pertencentes ao Estado do Rio Grande do Norte, e a fazenda Agrícola Famosa (Figura 8), no Estado do Ceará. 425pb Figura 7: Amostras de fragmentos de cDNA de raízes de meloeiro amplificados com primers genes específicos do MNSV. M – marcador de peso molecular; C+ – controle positivo. 65 425pb Figura 8: Amostras de fragmentos de cDNA de raízes de meloeiro amplificados com primers genes específicos do MNSV. M – marcador de peso molecular; C+ – controle positivo. Pode se ter como resposta para a não amplificação de todos os três primers genes específicos do MNSV, a quantidade pequena de esporos de resistência do O. bornovanus presente nas raízes das plantas analisadas, visto que, as partículas do vírus do MNSV ficam sobre a superfície desse fungo, e assim, em razão dessa quantidade, dificultou a extração do RNA do referido vírus. A utilização da técnica em que se trabalha com primers genes específicos como um método de identificação de vírus nos campos de produção, em especial o Vírus da Mancha Necrótica do melão, pode ajudar em uma rápida detecção da presença dos mesmos nas plântulas, e assim preventivamente controlar a enfermidade nos campos de cultivo do melão. Segundo Ferrer - Gual (2008) o diagnóstico dos vírus que produzem enfermidades nas plantas constitui o ponto de partida para adotar medidas adequadas de controle. Para o diagnóstico das enfermidades de origem viral, normalmente utilizam uma série de técnicas que permite identificar o vírus em nível de família, gênero e espécie. (ROBERTSON et al., 1991; XING et al., 2006). Muitas vezes, se o diagnóstico não for feito de maneira adequada, pode prejudicar na identificação do vírus específico estudado, pois alguns vírus, bem como fungos e bactérias, podem causar sintomas similares ao do MNSV. (DÍAS et al., 2003). 66 Herrera - vásquez et al. (2009) identificaram o MNSV em raízes de plantas de melão cultivadas em campo de cultivo na Guatemala, em Honduras, no México, no Panamá e na Espanha. Segundo esses autores, o MNSV ocorreu em todas as espécies de Cucurbitáceas estudadas (melão, pepino e melancia). Também foi detectado por Kassem et al. (2007) o MNSV no Panamá, em uma das 224 amostras de plantas de abóbora analisadas. Mallor et al. (2006) ao analisarem pelo teste DAS-ELISA, a cultivar de melão Doublon, inoculadas com o MNSV, usando o Olpidium bornovanus como vetor, observaram que a base do hipocótilo, apresentou necrose após 2 meses de inoculação. E ao compararem a produção de frutos das plantas dessa cultivar com as que não foram inoculadas com o MNSV, observaram que não houve diferenças significativas entre ambas. Essa planta apresenta um gene que confere resistência ao referido vírus. De acordo com Campbell et al. (1996) o MNSV pode ser introduzido nas plântulas, na ausência do vetor (Olpidium bornovanus), porém, em níveis baixos. No entanto, quando o fungo e o MNSV estão presentes ao mesmo tempo, o primeiro favorece a transmissão do vírus nas raízes das plântulas. Em razão da sua elevada estabilidade, o Vírus da Mancha Necrótica do Melão pode se instalar em solos agrícolas, por meio da água utilizada para a irrigação. Gosalvez et al. (2003), identificaram o MNSV em amostras de água utilizada para a irrigação de plantas de melão em cultura hidropônica na Espanha. Os mesmos autores ainda informam que o MNSV pode ser introduzido nas áreas agrícolas por equipamentos infectados ou não removidos do campo. Estudos realizados por Gosalvez et al. (2003) identificaram que os níveis mais elevados do MNSV, foram detectados nas raízes das plantas de melão, no estagio inicial de desenvolvimento. De acordo com esses autores, as raízes parecem atuar como um forte reservatório para a penetração do MNSV, porém, as folhas também podem ser utilizadas para o diagnóstico preventivo e identificação do referido vírus. Em nossos estudos também verificamos que nos solos em que o MNSV estava presente, havia a associação com espécies de Olpidium, em especial o O. 67 bornovanus. Essa associação também foi observada por Herrera - Vásquez et al. (2009), os quais encontraram O. bornovanus nas amostras de plantas provenientes de outros países, nos quais identificaram o MNSV. 68 4 CONCLUSÃO Detectou-se o MNSV através de estudos moleculares em três das 10 fazendas analisadas nos Estados do Rio Grande do Norte e Ceará, representando assim, o primeiro relato de ocorrência desse vírus no Brasil. 69 REFERÊNCIAS ARRIEL, N.H.C. et al. Outras aplicações dos marcadores moleculares. In: BORÉM, A.; CAIXETA, T. Marcadores moleculares. Viçosa: UFV, 2009. Cap.6, p. 209-274. AVGELIS, A.D. Occurrence of Melon necrotic spot virus in Crete (Greece). Phytopath, v. 114, p. 365–372, 1985. BOS, L. et al. Further characterization of Melon necrotic spot virus causing severe disease in glasshouse cucumbers in the Netherlands and its control. Netherlands Journal of Plant Pathology, v. 90, p. 55–69, 1984. BLANCARD, D.; LECOQ, H. PITRAT, M. Enfermedades de las cucurbitáceas: observar, identificar, luchar. Madrid: Mundi-Prensa, 1991. p.301. 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