Comparação Entre Atividade Temefos E Neem

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10 UNIVERSIDADE PRESIDENTE ANTÔNIO CARLOS – UNIPAC FACULDADE REGIONAL DO VALE DO AÇO – FARV CURSO DE FARMÁCIA ELIOMAR FRANCISCO XAVIES PEREIRA LEANDRO CATARIANA LEAL MICHAEL BRUNO REZENDE GUIMARÃES COMPARAÇÃO ENTRE A ATIVIDADE LARVICIDA DO EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE NIM (Azadirachta indica) COM A ATIVIDADE LARVICIDA DO ORGANOFOSFORADO TEMEFÓS, UTILIZADO ATUALMENTE NO COMBATE AO MOSQUITO Aedes aegytpi, VETOR DA DENGUE IPATINGA - MG 2009 11 ELIOMAR FRANCISCO XAVIER PEREIRA LEANDRO CATARINA LEAL MICHAEL BRUNO REZENDE GUIMARÃES COMPARAÇÃO ENTRE A ATIVIDADE LARVICIDA DO EXTRATO AQUOSO DAS FOLHAS DE NIM (Azadirachta indica) COM A ATIVIDADE LARVICIDA DO ORGANOFOSFORADO TEMEFÓS, UTILIZADO ATUALMENTE NO COMBATE AO MOSQUITO Aedes aegypti, VETOR DA DENGUE Monografia apresentada ao Curso de Farmácia da Universidade Presidente Antônio Carlos – UNIPAC -, como requisito parcial para a obtenção do título de Bacharel em Farmácia Generalista. Orientador: William Argolo Saliba IPATINGA – MG 2009 12 Dedicamos este trabalho a todos os nossos familiares, aos professores e aos formandos Generalista. do Curso de Farmácia 13 “Sua vida pode ser o que você quer que ela seja Conte suas bênçãos, não seus problemas. Você os superará, venha o que vier. Dentro de você há muitas respostas. Compreenda, tenha coragem, seja forte. Não coloque limites em si mesmo. Muitos sonhos estão esperando para serem realizados...” Autor desconhecido 14 AGRADECIMENTOS A DEUS que nos proporcionou e continuará proporcionando grandes vitórias. Ao Professor e Mestre Willian Argolo Saliba, pela amizade, orientação, incentivo e confiança. A Henilda Rodrigues Vieira funcionaria da Zoonose de Ipatinga, pela amostra do Organofosforado (temefós), utilizado na pesquisa. A Maria José, pelas folhas do nim, que foram de fundamental importância para realização da pesquisa. A funcionaria Clariana e estagiaria Lorena, pela paciência, e ajuda na realização do preparo dos ensaios de pesquisa. A Juliana Ferreira, pela revisão bibliográfica, ortográfica e abstract. Aos amigos pelo imenso apoio e solidariedade. A todos agradecemos sinceramente. 15 RESUMO Este estudo teve o objetivo de comparar a atividade larvicida sobre o Aedes aegypti, do extrato aquoso das folhas do Nim (Azadirachta indica), obtidos pelo processo de maceração manual, nos teores de 100%, 60%, 20%, com o organofosforado Temefós, utilizado atualmente no combate a Dengue. Observou-se que o extrato aquoso das folhas do Nim, além de matar as larvas, também inibe o desenvolvimento dessas. Baseado nos resultados obtidos, concluiu-se que o extrato aquoso das folhas do Nim no teor de 20% apresenta maior atividade larvicida. Este teor apresentou atividade larvicida semelhante ao organofosforado Temefós, embora este apresente ação mais rápida. O fato do extrato das folhas de Nim ser biodegradável e não tóxico ao homem e as larvas do mosquito Aedes aegypti estarem apresentando resistência ao efeito do organofosforado Teméfos, justifica a utilização do nim no combate ao mosquito vetor da dengue. Palavras-chave: Nim. Temefós. Aedes aegypti.Dengue. Atividade larvicida. 16 ABSTRACT This study aimed to compare the larvicidal activity of the Aedes aegypti, the aqueous extract of leaves of Neem (Azadirachta indica), obtained by the manual process of maceration, the levels of 100%, 60%, 20%, with the organophosphate Temephos , currently used to combat dengue. It was observed that the aqueous extract of leaves of Neem, and kill the larvae, also inhibits the development of these. Based on the results, we concluded that the aqueous extract of leaves of Neem in the content of 20% has increased larvicidal activity. This content showed larvicidal activity similar to organophosphate Temephos, although this present action faster. The fact that the extract from the leaves of Neem is biodegradable and nontoxic to humans and the larvae of the mosquito Aedes aegypti are showing resistance to the effect of organophosphate Temephos justifies the use of Neem in combating the mosquito vector of dengue. Keywords: Neem. Temephos. Aedes aegypti. Dengue. Larvicidal activity. 17 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS AChE - Acetilcolinesterase ANVISA – Agência Nacional de Vigilância Sanitária AZ – Azadiractina DENV – Vírus da Dengue DIVE – Diretoria de Vigilância Epidemiológica EMBRAPA – Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária OMS – Organização Mundial de Saúde OP- Organofosforado RNA – Ácido Ribonucléico RNA-m – RNA - mensageiro 18 LISTA DE ILUSTRAÇÃO Figura 1: Folhas e Flores do Nim ...........................................................................................15 Figura 2: Frutos do Nim ..........................................................................................................15 Figura 3: Árvore do Nim Adulta .............................................................................................16 Figura 4: Estrutura Química da Azadiractina .........................................................................17 Figura 5: Folhas de Nim Maceradas .......................................................................................25 Figura 6: Extrato Aquoso de Nim em Repouso ......................................................................25 Figura 7: Amostras das soluções utilizadas nos testes biológico ...........................................27 Figura 8: Resultado do controle da Água deionizada ............................................................28 Figura 9: Resultado da Atividade Larvicida do Extrato Aquoso das Folhas do Nim 100%...29 Figura 10: Resultado da Atividade Larvicida do Extrato Aquoso das Folhas do Nim 60%...29 Figura 11: Resultado da Atividade Larvicida do Extrato Aquoso das Folhas do Nim 40%...29 Figura 12: Resultado da Atividade Larvicida do Organofosforado Temefós .........................30 Figura 13: Resultado das Larvas mortas depois de retiradas dos extratos Nim .....................30 Tabela 1: Resultado da Atividade Larvicida do Extrato Aquoso das Folhas do Nim e o Organofosforado Temefós ......................................................................................................31 19 SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .............................................................................. 20 2 OBJETIVO ..................................................................................... 22 2.1 Objetivo geral .............................................................................. 22 2.2 Objetivo especifico ...................................................................... 22 3 REVISÃO DE LITERATURA ..................................................... 23 3.1 O Nim ........................................................................................... 23 3.1.1 Origem e descrição botânica ...................................................... 23 3.2 Azadiractina................................................................................. 25 3.2.1 Atividade biológica .................................................................... 27 3.3 Dengue .......................................................................................... 29 3.4 Temefós ........................................................................................ 30 3.4.1 Organofosforados ....................................................................... 30 4 METODOLOGIA .......................................................................... 32 4.1 Materiais e reagentes .................................................................. 32 4.2 Obtenção das folhas do Nim ...................................................... 33 4.3 Obtenção do Temefós ................................................................. 33 4.4 Obtenção das larvas .................................................................... 33 4.5 Preparo dos Extratos .................................................................. 33 4.6 Preparo das Soluções .................................................................. 35 4.7 Preparo da Solução Temefós ..................................................... 35 4.8 Avaliação da Atividade larvicida do extrato aquoso das folhas do Nim e da solução Temefós ........................................................... 37 4.9 Resultado da atividade larvicida do extrato aquoso das folhas do Nim e da solução Temefós ........................................................... 37 5 RESULTADO E DISCUSSÃO ..................................................... 41 6 CONCLUSÃO ................................................................................ 42 REFERÊNCIAS ................................................................................ 43 GLOSSÁRIO ..................................................................................... 47 ANEXO .............................................................................................. 48 20 1 INTRODUÇÃO Atualmente o uso de inseticidas representa gastos da ordem de bilhões de dólares em todo o mundo, para o combate aos insetos, tanto na agricultura como na área da saúde. Dengue é hoje um dos principais problemas de saúde pública em todo o mundo. A Organização Mundial da Saúde estima que cerca de 80 milhões de pessoas se infectem anualmente, em todo o mundo. Destas 500 mil necessitam de hospitalização e pelo menos 20 mil morrem por conseqüência da doença, o Brasil no ano de 1998 foi responsável por 530 mil casos notificados nas Américas. Até o dia 12 de março 2007 foram notificados 85.018 casos no país. No período de janeiro a fevereiro foram notificados 79.732 casos, o que representa um aumento de 29,58% quando comparado com o mesmo período de 2006 (SIMÕES, 2003). Para reduzir o número de pessoas infectadas pelo mosquito da dengue seu principal vetor, é muito utilizado inseticidas organofosforados, esses produtos tem um amplo espectro de ação atingindo com isso todos os insetos do meio ambiente onde for aplicado, ocasionando danos ecológicos e principalmente ao homem, visto que no organismo humano estes pesticidas atuam sobre o sistema nervoso central, resultando em alterações de comportamento, distúrbios sensoriais, do equilíbrio, da atividade da musculatura involuntária e depressão dos centros vitais, particularmente da respiração. Além disso os insetos podem adquirir resistência a estes inseticidas o que ira gerar a necessidade de utilização de maiores quantidades destes, causando com isso mais danos ao meio ambiente e ao homem (SIMÕES, 2003). O uso freqüente de inseticidas pode levar ao desenvolvimento de resistência do mosquito a estes compostos, comprometendo o controle e favorecendo a transmissão de doenças. O número de casos de resistência aos inseticidas está aumentando em países da Ásia, Caribe e Américas Central e do Sul (LIMA; OLIVEIRA, 2004.) Um inseticida natural que atualmente têm sido utilizado no mercado é o extrato de Nim. Esta é uma árvore pertencente à família Meliaceae, que apresenta diversas espécies vegetais conhecidas pela madeira de grande utilidade, como o mogno, o cedro, a santa bárbara, ou cinamomo, o cedrilho, a canjerana, a triquília, etc. É originário do Sudeste da Ásia e é cultivado em diversos países da Ásia, em todos os países da África, na Austrália, América do Sul e Central. É usado há séculos na Ásia, na Índia, como planta medicinal. Tem diversos usos, em especial anti-séptico, curativo ou vermífugo; é utilizado no preparo de sabões medicinais, cremes e pastas dentais. A árvore é usada para sombra e possui madeira de qualidade para a produção de móveis, construção, batentes e portas, caixas e caixotes, lenha, 21 carvão, etc. Seu uso como inseticida se tornou bem conhecido nos últimos 30 anos, quando seu principal composto, a azadiractina, foi isolado. A molécula da azadiractina é muito complexa e ainda não pôde ser sintetizada; assim, todos os produtos que contêm azadiractina são produzidos por extração da planta. Os inseticidas naturais de Nim são biodegradáveis, portanto não deixam resíduos tóxicos nem contaminam o ambiente. Possuem ação repelente, anti-alimentar, reguladora de crescimento e inseticida, além de acaricida, fungicida e nematicida. Por sua natureza, os extratos de Nim são mundialmente aprovados para uso em cultivos orgânicos (MARTINEZ, 2002). 22 2 OBJETIVO 2.1 Objetivo geral • Comparar a atividade larvicida do extrato aquoso das folhas do Nim nos teores 20%, 60% e 100% com o Organofosforado Temefós – inseticida utilizado atualmente no combate as larvas do mosquito Aedes aegypti. 2.2 Objetivo especifico • Verificar se a atividade larvicida do extrato aquoso das folhas do Nim nos teores de 20%, 60% e 100% (Azadirachta Indica) é maior do que a atividade larvicida do organofosforado Temefós. • Verificar em qual teor o extrato aquoso das folhas do Nim (Azadirachta indica) apresenta maior atividade larvicida. 23 3 REVISÃO DE LITERATURA 3.1 O Nim 3.1.1 Origem e descrição botânica O Nim (Azadirachta indica A. Juss.) é uma planta da família Meliácea, de origem asiática, natural de Burma e das regiões áridas da Índia (SAXENA, 1983 apud INSTITUTO AGRONÔMICO - IAC). Atualmente encontra-se distribuída nas Américas e outras regiões de clima tropical e subtropical (SOON; BOTTRELL, 1994 apud VIDIGAL, et al., 2007), onde adapta-se bem, sendo que seu potencial máximo de desenvolvimento varia em temperaturas entre 20 e 32º C (GRUBER, 1992 apud IAC). É mais resistente a altas temperaturas, por exemplo, acima de 44ºC por curto espaço de tempo, não tolerando assim geadas, podendo comprometer seu crescimento. O pH ideal de solo para cultivo varia entre 6,2 e 7,0 (NEVES; OLIVEIRA; NOGUEIRA, 2003). Desde sua introdução no Brasil, em 1984, o Nim tem demonstrado boa adaptação por ser mais resistente às altas temperaturas do que as baixas, sendo assim resistente à seca, o que favorece seu cultivo no Norte e Nordeste do Brasil, regiões que estão ampliando seu cultivo (ORGANEEM, 2003 apud VALENTE, et al., 2007). O Nim é uma árvore muito resistente, e inicia seu estágio reprodutivo de desenvolvimento a partir de 3 a 5 anos de idade, mas não atingem o pico máximo de produtividade antes de 10 anos de idade (SANTOS; ANDRADE, 2000). As folhas são verde-escuras, compostas e imparipinadas, são aglomeradas nos extremos dos ramos simples e sem estípulas e as flores são de coloração branca e aromática (figura 1). O fruto é ovalado com 1,5 a 2,0 cm de comprimento (figura 2) e quando maduro, apresenta poupa amarela e casca branca dura contendo um óleo marrom no interior de uma semente (NEVES; OLIVEIRA; NOGUEIRA, 2003). Do ponto de vista econômico, a árvore do Nim representada na figura 3, apresenta muitas vantagens, como o fato de crescer em solos secos, pobres ou até mesmo bastante ácidos. Apresenta uma fisiologia única, retirando de solos arenosos elementos nutritivos para o seu desenvolvimento. Com folhas e ramos caídos, consegue se desenvolver mesmo com raízes pouco profundas, pois este mecanismo diminui a perda de água para o meio (SANTOS; ANDRADE, 2000). A planta é conhecida há cerca de 5.000 anos e apresenta ação contra mais 24 de 430 espécies de pragas (MARTINEZ, 2002). Causa múltiplos efeitos nos insetos, como: repelência, redução da alimentação, repelência de postura, atraso no desenvolvimento, redução da fertilidade e fecundidade, interrupção no desenvolvimento e na ecdise, e muitas outras alterações na fisiologia e no comportamento dos insetos, podendo também ocasionar morte destes (MARTINEZ, 2002 apud FILHO, 2005). FIGURA 1: Folhas e flores do Nim. FONTE: Plante Biodiesel. Manuais Cultura do Nim. FIGURA 2: Frutos da árvore do Nim. FONTE: Plante Biodiesel. Manuais Cultura do Nim. 25 O Nim contém um variado grupo de substâncias bioativas com alto efeito biológico. (NARAGNAN; SING; SAWAINAP, 1980 apud IAC). Entre as substâncias estão a azadiractina, um dos compostos mais potentes (EMBRAPA, 2006). FIGURA 3: Árvore do Nim adulta. FONTE: Santos; Andrade, 2000. 3.2 Azadiractina Os estudos sobre estrutura química da azadiractina começaram em 1972, devido sua complexidade, estenderam-se por 18 anos. Descobriu-se que o azadiractina é moderadamente solúvel em água, solúvel em etanol, metanol, acetona, clorofórmio. Insolúvel em éter etílico e éter de petróleo (SANTOS; ANDRADE, 2000). Sensível aos raios ultravioletas, apresentando rápida biodegradação. A azadiractina é muito instável em altas temperaturas, em presença de luz e de umidade (DAMARLA, 2001 apud IAC). Pesquisas de Ermel et al., (1987) demonstraram que a atividade da azadiractina pode ser reduzida em 10% quando exposta a temperaturas acima de 50ºC durante 24 horas (SCHUMUTTERER, 1990). Por isso se torna importante tomar os devidos cuidados durante os processos de colheita, secagem e armazenamento das folhas e sementes. 26 A azadiractina é o composto mais eficiente extraído da planta Azadirachta indica A. Juss, rica em propriedades inseticidas e larvicidas (NEVES; OLIVEIRA; NOGUEIRA, 2003). A substância é encontrada em todas as partes da planta de Nim: folhas, frutos e sementes (CHAMPAGNE et al., 1992, apud VIDIGAL, et al., 2007), sendo nas sementes encontrada em maior concentração. A molécula da azadiractina é muito complexa e ainda não foi possível sintetizá-la em laboratório, por isso, todos os produtos que possuem essa substância são produzidos com o extrato da planta (MARTINEZ, 2002 apud FILHO, 2005). A estrutura química da azadiractina é formada por um grupo fechado de isômeros relacionados, denominados AZ-A até AZ-G (NEVES, 2005). De acordo com ANVISA (2006) o nome químico da azadiractina é dimethyl (2aR,3S,4S,4aR,5S,7aS,8S,10R,10aS,10bR) -10- acetoxy- 3,5- dihydroxy -4- [(1aR,2S,3aS,6aS,7S,7aS) -6a- hydroxy-7ª methyl- 3a,6a,7, 7a-tetrahydro -2,7-methanofuro [2,3-b] oxireno[e] oxepin- 1a(2H)-yl] - 4- methyl-8- { [(2E)2-methylbut-2-enoyl] oxy} octahydro- 1Hnaphtho [1,8a-c:4,5-b′c′] difuran-5,10ª (8H) dicarboxylate; massa molecular é 720,7 0U(Dalton); fórmula bruta é C35 H44O16; fórmula estrutural está representada na figura 4. FIGURA 4: Estrutura química da azadiractina. FONTE: ANVISA, 2006. Uma característica comum às espécies da família Meliácea é a presença de triterpenos oxigenados, conhecidos como meliacinas, sendo a azadiractina o mais promissor agente antialimentar. A azadiractina assemelha-se muito a um esteróide tetranortriterpenóide, também chamado de limonóide (NEVES; OLIVEIRA; NOGUEIRA, 2003). Outros compostos biologicamente ativos podem ser extraídos das diferentes partes da árvore do Nim, incluindo triterpenóides, compostos fenólicos, carotenóides, esteróides e cetonas. Através de diferentes processos podem ser extraídos por volta de 24 compostos com atividades biológicas, porém apenas quatro desses compostos apresentam alta eficiência como pesticidas: azadiractina, salanina, melantriol e nimbina (SANTOS ; ANDRADE, 2000). Essas 27 substâncias apresentam efeitos diversos como inibição da alimentação, repelência, diminuição da oviposição, interrupção da ecdise, redução da fertilidade e fecundidade e aumento da mortalidade de insetos (MORDUE; NISBET, 2000; TEDESHI et al., 2001; KUMAR et al., 2005 apud MOURÃO, 2008). A azadiractina tem recebido mais atenção dos pesquisadores, por apresentar isoladamente efeitos mais seletivos para os insetos que o extrato de Nim com todos os compostos juntos (HOWATT, 1994 apud SANTOS; ANDRADE, 2000). 3.2.1 Atividade biológica A azadiractina presente no Nim é muito eficiente para inibir a alimentação e a postura de ovos dos insetos nas plantas tratadas (EMBRAPA, 2006). Segundo Martinez (2002) a presença de extratos do Nim sobre uma superfície pode diminuir o número de ovos depositados pelos insetos, devido à maior presença de quimiorreceptores de algumas espécies, capazes de detectar a presença de azadiractina, atuando tanto na diminuição de alimentação, quanto na postura. Atua no atraso do crescimento dos insetos, dificultando seu desenvolvimento. (EMBRAPA, 2006). Segundo Schumutterer (1990) o isômero AZ-E é considerado o mais efetivo regulador de crescimento dos insetos. O Deacetilazadiractinol age através de interrupções no desenvolvimento larvais, para chegar à fase adulta, determinando assim alterações morfológicas na formação da asa do inseto podendo também afetar outros órgãos. O Nim tem ação ovicida e larvicida, impede a eclosão dos ovos, mata larvas de insetos, principalmente por sua ação hormonal (EMBRAPA, 2006). Segundo Filho et al., (2005) este composto age no sistema neurossecretor do inseto, interferindo assim no desenvolvimento das formas jovens de insetos abruptamente. A azadiractina mostrou através de estudos, alterar os teores da ecdisona e de outros hormônios ecdisteróides na hemolinfa, possivelmente por alterar a perfeita síntese e liberação de hormônio que estimula a produção de ecdise (hormônio que possibilita ao inseto trocar o esqueleto externo e crescer), pelas glândulas protorácicas, assim o aumento da concentração desse hormônio que não foi liberado, reduzirá a síntese das células neurossecretoras do cérebro (MORDUE; BLACHWELL, 1993). Podendo ocasionar: • Total inibição da ecdise, não permitindo que ela se inicie
os insetos ficam inativos por um período geralmente seguido de morte; 28 • Interrupção da ecdise
pode acontecer durante fase larval, ninfa e durante período de pupa, causando a morte do inseto; • Ecdise incompleta
em casos de transformação de fase larval para pupa, formando características intermediárias e anormais presentes em ambos os estágios referidos. Podendo deixar partes dos tegumentos velhos, aderidas ao novo e mutilar extremidades mais delicadas dos insetos, como partes bucais, indiretamente a ecdise imperfeita vai interferir na alimentação e na locomoção. Este composto reduz a fecundidade e fertilidade, afetando tanto no estágio reprodutivo de várias espécies de insetos, quanto na fase adulta e na fase larval, com concentrações sub-letais. A azadiractina parece afetar indispensáveis processos relacionados à maturação reprodutiva tanto em machos e fêmeas, retardando o início do acasalamento e também o início do período de postura de ovos (MARTINEZ, 2002 apud FILHO et al., 2005). Segundo Neves (2005) atualmente, em todo mundo, o combate as pragas vem sendo feito através de aplicação de inseticidas, principalmente organo sintéticos, esses são altamente tóxicos e prejudiciais ao ambiente e a saúde humana (MARQUES et al., 2004 apud ARROTEIRA,;KEMMELMEIER,;MACHINSKI, 2007). Na busca por inseticidas seguros, a azadiractina foi identificada como a substância mais promissora, pois possui grande ação contra os insetos e sua toxicidade é baixa (MARTINEZ, 2002 apud FILHO et al., 2005). Além de ser reconhecida por múltiplas propriedades terapêuticas, inseticidas, nematicidas e fungicidas (MOSSINI; KEMMELMEIER, 2005). Segundo Chopra (1958), a atividade inseticida do Nim foi publicada pela primeira vez em 1928 (apud NEVES, 2005). É muito importante salientar que muitas espécies de insetos que já haviam se tornado resistente aos inseticidas sintéticos presentes no mercado, são perfeitamente controladas pelo Nim (HOWATT, 1994 apud SANTOS; ANDRADE, 2000). Os inseticidas naturais de Nim são biodegradáveis, portando não deixam resíduos tóxicos por não haver acúmulo de contaminantes na cadeia alimentar, e por não deixar resíduos no solo, na água e nos produtos vegetais. (SODEPAZ, 2006). Os extratos de plantas com potencial inseticida têm sido utilizados em sistemas de produção em que não é permitido o uso de agrotóxicos, como na produção orgânica e em alguns sistemas familiares, devido à facilidade de aquisição e ao custo relativamente baixo, quando comparado aos inseticidas convencionais (VENZON, et al., 2007). O Nim, como potente inseticida natural sem contra indicações, permite o uso contínuo e á longo prazo, sem causar dano algum à saúde dos animais e sem ser prejudicial ao 29 homem (FILHO et al., 2005). Por se tratar de um produto orgânico e biodegradável, o seu efeito é lento, havendo necessidade de maior número de aplicações, quando comparado com os inseticidas sintéticos. Seu tempo de meia vida no solo é de mais ou menos 20 dias (EMBRAPA, 2006). 3.3 Dengue É uma doença típica de áreas tropicais e subtropicais, causada por vírus, transmitida pelo Aedes aegypti (Brasil) e Aedes albopictus (Ásia), geralmente de caráter epidêmico (que atinge um número muito grande de pessoas em um dado momento). Os mosquitos (família Culicidae) são caracterizados por possuírem dois pares de asas, sendo um desses pares atrofiado. São conhecidos popularmente como pernilongos. Nesta família encontram-se os mosquitos transmissores de doenças como: Dengue: Aedes aegypti e Aedes albopictus (Ásia); Febre Amarela Urbana: Aedes aegypti (DIVE- DIRETORIO DE VIGILANCIA EPIDEMIOLOGIA. 2007). Existem evidências de que tenha se originado na África, vivendo em ambientes silvestres, nos tocos das árvores e escavações em rochas. Esta espécie se diferenciou adaptando-se aos centros urbanos, onde as alterações provocadas pelo homem propiciam sua proliferação. Nas Américas somente tem sido encontrada a variedade doméstica, que se acredita tenha sido transportada em barris que vinham dos navios de exploradores e colonizadores (DIVE. 2007). Vive na faixa tropical e sub-tropical da Terra, limitada pela temperatura em torno de 10º C, na altitude aproximada de 1000 metros. Foi registrada em todos os países das Américas, com exceção do Canadá. No Brasil esta espécie é detectada em todo o território (DIVE. 2007). O vírus da Dengue e representado por quatro sorotipos: DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4. A fonte de infecção e hospedeiro vertebrado é o homem. Na Ásia e na África foi descrito um ciclo selvagem envolvendo macaco. A transmissão se faz quando um mosquito fêmea pica uma pessoa com Dengue (no período de 1 dia antes até 5 dias após o aparecimento dos primeiros sintomas) na fase de viremia (presença do vírus no sangue) e suga o sangue com vírus. Os vírus vão se localizar e se multiplicar no aparelho digestivo e glândulas 30 salivares do mosquito fêmea, que após 8 a 12 dias está pronta para transmiti-lo a todas as pessoas que picar durante a sua vida 6 a 8 semanas (DIVE. 2007). O período de Incubação (entre a entrada do vírus no organismo humano e o aparecimento dos sintomas) e de 3 a 15 dias da picada pelo Aedes aegypti infectado, surgem os primeiros sintomas da Dengue. O período médio de incubação é de 5 a 6 dias (DIVE. 2007). 3.4 Temefós 3.4.1 Organofosforados O termo genérico ‘organofosforado’ (OP), atualmente usado, inclui todos os inseticidas que contêm fósforo. Esses inseticidas foram descobertos posteriormente aos organoclorados ( CRINNION, 2000). No grupo dos organofosforados, classificamos os inseticidas em três subgrupos: os alifáticos (malation, vapona, vidrin, etc.); os derivados de fenil (etil e metil paration, fenitrotion, etc.); e os heterocíclicos (clorpirifos, clorpirifos-metil, etc.). São amplamente utilizados em Saúde Pública por apresentarem muitas vantagens sobre os organoclorados, como serem biodegradáveis e não se acumularem nos tecidos. Apresentam, porém, como principal desvantagem, a instabilidade química, o que torna obrigatória a renovação periódica de sua aplicação. Além disso, são mais tóxicos para os vertebrados que os organoclorados, mesmo em doses relativamente baixa (PALCHICK, 1996, apud WARE, 2000). O uso continuado de inseticidas, tanto na agricultura e pecuária como na área da Saúde Pública, tem provocado o aparecimento de populações resistentes e ocasionado problemas para o controle de vetores (PALCHICK, 1996, apud WARE, 2000). O organofosforado Temefós, registrado nos EUA em 1965, para utilização em agricultura e controle de mosquitos, é o único larvicida desse grupo com uso generalizado no controle de larvas de mosquitos, recomendado pela OMS para uso em água potável (CHAVASSE, 1997). Os organofosforados atuam inibindo a Acetilcolinesterase (AChE), importante enzima do sistema nervoso central. Essa enzima é fosforilada pelo inseticida, ficando irreversivelmente inativada. A inibição de AChE resulta no acúmulo de acetilcolina nas junções nervosas (ou sinapses), o que impede a interrupção da propagação do impulso 31 elétrico. Consequentemente, o sistema nervoso central continuará sendo estimulado, desencadeando o processo de paralisia que pode culminar com a morte do inseto (CHAVASSE, 1997). 32 4 METODOLOGIA Utilizou-se primeiramente a pesquisa bibliográfica, que busca conceitos e abordagens dentro de um quadro de referência, adotando artigos de análise e diversas publicações do tema, e ainda pesquisa laboratorial onde buscou-se reunir informações específicas a fim de comparar a atividade larvicida do extrato aquoso da folha do Nim com o organofosforado Temefós. As análises práticas foram realizadas no laboratório de química da Universidade Presidente Antônio Carlos, campus Ipatinga – MG. No mês de maio de 2009. 4.1 Materiais e reagentes • 15 Balões Volumétricos de 250 ml. • Agitador Magnético. • Água Deionizada. • Balança Analítica. • Balão Volumétrico de 2 L. • Bastão de Vidro. • Béquer de 250 ml. • Conta gotas. • Elástico. • Espátula. • Folhas da Planta Nim “in natura”. • Funil de Vidro. • Gaze. • Gral e pistilo de porcelana. • Lupa. • Papel Alumínio. • Papel de Filtro. • Proveta de 100 ml e 50 ml • Temefós Fersol 1G. • Vidro de Relógio. 33 4.2 Obtenção das folhas do Nim Para a preparação do extrato aquoso foram coletadas folhas de Nim no Sítio Paradouro situado no município de Timóteo – MG. As árvores do Nim tinham em média cinco anos. Após a coleta, as folhas foram refrigeradas em uma geladeira convencional em temperatura que varia entre 1,7 a 3,30 C para melhor conservação, com objetivo de não haver a degradação dos princípios ativos (NEVES; OLIVEIRA; NOGUEIRA, 2003). 4.3 Obtenção do Temefós O TEMEFÓS FERSOL 1 G, foi cedido pela zoonose do município de Ipatinga - MG. 4.4 Obtenção das larvas As larvas do mosquito Aedes aegypti foi cedidas pela zoonose do município de Coronel Fabriciano – MG, essas larvas encontravam-se em diversos estágios de desenvolvimento. As larvas foram coletas no mesmo dia do preparo do extrato. Confirmou-se que as larvas testadas se tratavam do Aedes aegypti através de suas características morfológicas, verificadas por lupa. 4.5 Preparo dos Extratos Para a obtenção do extrato aquoso do Nim foi utilizado 25,50g de folhas verdes “in natura” em uma proporção de 2 litros de água deionizada (EMBRAPA, 2006). As folhas foram maceradas manualmente num graal com a utilização de pistilo, ambos de porcelana, conforme representado na figura 6. Em seguida, colocou-se a água em um balão volumétrico de 2 litros e adicionou- se o extrato obtido na maceração, deixando-o em repouso por 12 horas, representado na figura 7. Este foi isolado com papel alumínio com objetivo de proteger seus princípios ativos devido à fotosensibilidade dos mesmos, em seguida armazenados em geladeira. 34 Filtrou-se o extrato utilizando-se filtro de papel e em seguida dilui-se o extrato aquoso para então ser testado nos teores 20%, 60% e 100%. FIGURA 5: Folhas de Nim maceradas. FONTE: Autor FIGURA 6: Extrato aquoso de Nim em repouso. FONTE: Autor. 35 4.6 Preparo das Soluções Para as análises foram utilizados 15 balões de fundo achatado de 250 ml cada um. O esquema utilizado para a verificação da atividade larvicida do extrato aquoso do Nim, foi à seguinte: • Amostra 1 (A, B, C) – Água deionizada (Controle) 3 Balões contendo 250 ml de água deionizada e 3 larvas, respectivamente. • Amostra 2 (A, B, C) – Teor do extrato: 100% 3 Balões contendo 250 ml do extrato aquoso do Nim e 3 larvas, respectivamente. • Amostra 3 (A, B, C) – Teor do extrato: 60% 3 Balões contendo 150 ml do extrato aquoso do Nim, diluídos em 100 ml de água deionizada e 3 larvas, respectivamente. • Amostra 4 (A, B, C) – Teor do extrato: 20% 3 Balões contendo 50 ml do extrato aquoso do Nim, diluídos em 200 ml de água deionizada e 3 larvas, respectivamente. 4.7 Preparo da Solução Temefós O TEMEFÓS FERSOL 1G, foi previamente triturado no gral com o pistilo ambos de porcelana, devido à granulométrica do pó. Pesou-se exatamente 0, 012 mg para o preparo da solução Temefós. Para solubilização do Temefós na água deionizada, utilizou o agitador magnético com auxilio da barra magnética por 15 minutos. • Amostra 5 (A, B, C) – Solução Temefós (0, 012 mg/L), segundo metodologia padronizada pela Organização Mundial da Saúde. 36 3 Balões contendo 250 ml de solução larvicida e 3 larvas, respectivamente. As amostras estão ilustradas na figura 8. Obs: Cada amostra foi realizada em triplicata, denominadas A, B, C, colocando 3 larvas do Aedes aegypti em cada balão Volumétrico. FIGURA 7: Amostras das Soluções utilizadas no teste biológico. FONTE: Autor. Após o preparo dos balões, verificou-se a temperatura com intuito de evitar que as larvas sofressem choque térmico, onde ambos apresentavam temperatura de 240 C. Os balões foram devidamente tampados com gaze e esta foi presa com elástico. As amostras foram acondicionadas no laboratório em local reservado, sendo abrigadas da incidência direta da luz do sol. A fim de avaliar a atividade larvicida do extrato aquoso do Nim e do organofosforado Temefós, verificou-se as amostras após um intervalo de 216 horas (nove dias), pois o tempo total de ovo até a fase adulta do mosquito leva em média 7 a 8 dias. (DIVE, 08/2007). 37 4.8 Avaliação da Atividade larvicida do extrato aquoso das folhas do Nim e da solução Temefós O monitoramento da ação larvicida do extrato aquoso das folhas do Nim e solução Temefós, foi verificada diariamente balão por balão (A, B, C) de cada teor 0 % (controle), 20%, 60 %, 100 % e Temefós 0, 012 mg/L. contabilizando o numero de larvas vivas e mortas, o número de pupa vivas e mortas, o número de larvas e pupa que tiveram o ciclo de desenvolvimento inibido e o número mosquitos vivos e mortos. Em um período de nove dias, tempo em media, para o desenvolvimento do Ovo ate a fase adulta do mosquito. 4.9 Resultado da atividade larvicida do extrato aquoso das folhas do Nim e da solução Temefós Demonstrados em forma de gráfico, nas figuras 8, figura 9, figura 10 figura 11, figura 12. O controle 0 % e utilizado para se ter uma base comparativa com a ação larvicida do Extrato aquoso das folhas do Nim e o Organofosforado Temefós. FIGURA 8: Resultado do controle da Água Deionizada. 38 FIGURA 9: Resultado da atividade Larvicida do Extrato Aquoso do Nim 100 %. FIGURA 10: Resultado da atividade Larvicida do Extrato Aquoso do Nim 60 %. FIGURA 11: Resultado da atividade Larvicida do Extrato Aquoso do Nim 20 %. 39 FIGURA 12: Resultado da atividade Larvicida do Organofosforado Temefós 0,012 mg/L. Após o período de nove dias, com o intuito de verificar se as larvas sobreviventes iriam atingir o último estágio de desenvolvimento nas amostras de teores 100% uma Larva viva e 60% cinco Larvas vivas, essas foram transferidas para um balão contendo 250 mL de água deionizada. E após o período de 140 horas, observou todas estavam mortas (figura 13). FIGURA 13: Resultado das Larvas mortas depois de retiradas dos extratos das folhas do Nim. 40 TABELA 41 5 RESULTADO E DISCUSSÃO De acordo com tabela 1, observou-se que após 9 dias, 11% das larvas do controle (água deionizada), transformaram-se em mosquito, 44,5% das larvas morreram e a mesma porcentagem permaneceram vivas. No teor de extrato 100% verificou-se que 89,0% das larvas morreram e 11% permaneceram vivas. Já no teor de extrato 60%, 44,5% das larvas permaneceram vivas e 55,5% não sobreviveram. As amostras que apresentaram maior atividade larvicida foram o extrato de teor de 20% e solução de Temefós 0, 012 mg/L, pois nessas amostras todas as larvas foram mortas. Foi observado que na amostra de teor de extrato 20%, uma das larvas atingiu o estágio de pupa, morrendo em seguida. Tal resultado confirma que o extrato da folha árvore do Nim no teor de 20% (azaradiractina indica) apresenta atividade larvicida semelhante ao Teméfos, no entanto a ação do organofosforado Teméfos é mais rápida, pois após 36 horas verificou-se que todas as larvas da amostra contendo esse inseticida foram mortas. Pelos resultados obtidos, pode-se verificar também que a atividade biológica do extrato não está relacionada a um teor maior. Com o intuito de verificar se as larvas sobreviventes iriam atingir o último estágio de desenvolvimento nas amostras de teores 100% e 60%, essas foram transferidas para um balão contendo 250 mL de água deionizada. Observou-se que todas as larvas morreram, após 140 horas. Tal resultado sugere que o extrato das folhas de Nim, apresenta atividade inibidora do ciclo de desenvolvimento do mosquito Aedes aegypti. Esse resultado é confirmado pela citação de Martinez (2002), onde o autor relata que a azadiractina encontrada no extrato do Nim, possui diversos efeitos biológicos sobre insetos como: inibição da alimentação, interrupção da ecdise, afeta o desenvolvimento e a transformação de diversos modos e aumenta a mortalidade desses. 42 6 CONCLUSÃO Segundo os resultados obtidos, pôde-se concluir que o extrato aquoso das folhas do Nim de maior atividade larvicida é o de teor 20%. Está concentração apresentou atividade larvicida semelhante ao organofosforado Temefós, embora este apresente ação mais rápida. O fato do extrato das folhas de Nim ser biodegradável e não tóxico ao homem e as larvas do mosquito Aedes aegypti estarem apresentando resistência ao efeito do organofosforado Teméfos (LIMA; OLIVEIRA, 2004) justifica a utilização do Nim no combate ao mosquito vetor da dengue. Testes estatísticos e comparativos com outros inseticidas convencionais devem ser realizados com o intuito de comparar a atividade larvicida do extrato aquoso do Nim, permitindo assim que essa substância seja utilizada no combate do vetor Aedes aegypti. Desenvolvimento de técnicas que permitam isolar a Azadiractina. Estudos com demais partes da planta, como os frutos, sementes e casca. 43 REFERÊNCIAS ARROTEIA, C. C.; KEMMELMEIER, C.; MACHINSKI JUNIOR, M. Efeito dos extratos aquoso e oleoso de Nim [Azadirachta indica A. Juss (Meliaceae)] na produção de patulina em maçãs contaminadas por Penicillium expansum. Cienc. Rural [online]. 2007, vol. 37, no. 6, pp. 1518-1523. 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Toxicidade dos inseticida metamidofós, imidaclopride – beta-ciflutrina e extrato de neem (Azadirachta indica) ao predador Podisus nigrispinus (Heteroptera: Pentatomidade) em plantas de soja. Orientador: José Cola Zanuncio. Co-orientadores: Germano Leão Demolin Leite, José Milton Milagres Pereira, Carlos Sigueyuki Sediyama e Teresinha Vinha Zanuncio. NARAGNAN, C. R.; SING, R. P.; SAWAINAP, D. D. Phagodeterrency of various fractions of neem oil against Schistocerca gregaria Forsk. Indian Journal of Entomology, New Delhi, 1980. v.43, n.3, p. 469-472. NEVES, B. P.; OLIVEIRA, I. P.; NOGUEIRA, J. C. M. Cultivo e utilização do nim indiano. Circular técnica, 2003. Disponível em: http://www.cnpaf.embrapa.br/publicacao/circulartecnica/circ_62.pdf. Acesso em: 20 de maio. 2009. NEVES, B. P. et al. Utilização Medicinal do Nim. Revista Eletrônica Faculdade Montes Belos, Goiás, ISSN 1808-8597, v.1, n.1, p. 107-118, agosto, 2005. 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Processo que permite ao inseto trocar o esqueleto externo, possibilitando o seu crescimento. FLAVIVÍRUS – vírus esféricos, envelopados, com projeções na superfície pertencentes ao gênero Flavivirus e família Flaviviridae. Possuem uma fita única de RNA, contendo aproximadamente onze mil nucleotídeos, a qual se comporta como RNA mensageiro. NIM – Azadirachta indica- é uma planta pertencente à família Meliaceae, de origem asiática. 48 ANEXO 49 CERTIFICADO DE ANALISE TEMEFÓS 50 CICLO DE REPRODUÇÃO DO MOSQUITO Aedes aegypti DESENVOLVIMENTO O mosquito, até completar seu desenvolvimento, passa pelas fases de: ovo, larva, pupa e mosquito adulto (Figura 1). As fases larva e pupa ocorrem na água (DIVE 2007). FIGURA 1: Ciclo de Desenvolvimento. FONTE: DIVE. Diretoria de Vigilância Epidemiológica. 2007 Ovo As fêmeas de Aedes aegypti colocam seus ovos fixando-os em paredes úmidas, próximas ao nível da água. O tamanho varia entre 0,6 a 0,7mm. Estes ovos suportam grandes períodos de seca (podem persistir na natureza por aproximadamente 18 meses), sem sofrer nenhum dano. Com a umidade as larvas eclodem. (DIVE 2007). Larvas As larvas vivem na água se alimentando e vindo à superfície para respirar. Mudam de tamanho 4 vezes (o que chamamos de estádios). A atividade alimentar é intensa e rápida. Alimentam-se de algas e partículas orgânicas dissolvidas na água. Não resistem a longos períodos sem alimentação. Não toleram águas muito poluídas e luz intensa (DIVE 2007). 51 A larva é composta de cabeça tórax e abdômen. No final do abdômen encontra-se o segmento anal e o sifão respiratório. O sifão é curto, grosso (quando comparado aos mosquitos do gênero Culex) e mais escuro que o corpo. Para respirar, a larva vem à superfície, onde fica em posição quase vertical. Movimenta-se em forma de serpente, fazendo um “S” em seu deslocamento. Quando há movimentos bruscos na água e sob feixe de luz desloca-se com rapidez para o fundo do depósito demorando para retornar à superfície. Após o 4º estádio as larvas se transformam em pupas de 3 a 4 dias (DIVE 2007). Pupas Durante esta fase não se alimentam, utilizando a energia armazenada na fase larvária. A pupa é dividida em cefalotórax (cabeça + tórax) e abdômen tendo o formato de uma vírgula. Tem um par de tubos respiratórios ou trombetas, que atravessam a água e permitem a respiração. Nesta etapa, sofrem as últimas transformações para a formação do adulto (DIVE 2007). Após 2 a 3 dias, emerge o adulto. O tempo total de ovo até a fase adulta leva em média 7 a 8 dias. Dependendo da temperatura, por exemplo, temperaturas abaixo de 20ºC este período do desenvolvimento pode ser mais extenso (DIVE 2007). Adultos Necessitam de um período de várias horas para endurecimento do esqueleto externo e das asas. Dentro de 24 horas podem voar e acasalar. As fêmeas se alimentam freqüentemente de sangue, de preferência humano. Na falta deste, pode se alimentar de sangue de outros animais. Machos, e também fêmeas, alimentam-se de sucos vegetais, fontes de carboidratos, para os processos metabólicos para a manutenção básica da vida (DIVE 2007). O repasto sanguíneo (refeição) das fêmeas fornece proteína para maturação dos ovos, acontecendo geralmente durante o dia, com picos de maior atividade ao amanhecer e pouco antes do entardecer. Quando o repasto não é completo, pode alimentar-se mais de uma vez entre duas posturas, principalmente quando são perturbadas durante o repasto. Em condições ótimas o intervalo entre o repasto e a oviposição (postura dos ovos) é de três dias. As oviposições ocorrem geralmente no final da tarde. A fêmea grávida é atraída para recipientes 52 escuros, sombreados, úmidos ou com água, com superfícies ásperas nas quais depositam os ovos (DIVE 2007). Preferem água limpa ao invés de água poluída ou com muita matéria orgânica. Em cada postura a fêmea distribui seus ovos em vários recipientes de preferência artificiais como pneus, latas, garrafas, floreiras que acumulam água da chuva (DIVE 2007). Costumam invadir caixas d’água e cisternas mal vedadas ou piscinas, aquários mal cuidados, vasos com água no interior de residências e nos cemitérios (DIVE 2007). Tanto no Brasil quanto em outros países americanos o Aedes aegypti tem sido surpreendido criando-se em recipientes naturais como bromélias, buracos em árvores, escavação em rocha e bambu. Escavações no solo com fundo argiloso ou forrado de cimento ou pedra, também são empregadas por esse mosquito para se criar. Tais encontros são muito raros em comparação com os criadouros preferenciais (DIVE 2007). A tendência do Aedes aegypti é permanecer onde nasceu, abrigado dentro das habitações. Quando a quantidade de mosquito é muito grande (densidade alta), ele se espalha para diversos pontos (dispersa) num vôo em torno de 100 metros. A fêmea grávida, quando não encontra depósitos para oviposição, pode se deslocar através do vôo até 1000 metros. Vive em média 30 a 35 dias na natureza, podendo ser maior este período no laboratório. Deposita em média 400 a 600 ovos durante a vida. Seu tamanho médio é de 3 mm. Possuindo cor amarronzada, com anéis brancos nas patas e um desenho prateado em forma de lira na parte dorsal do tórax e escamas prateadas no corpo (DIVE 2007).