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Metodologia básica da Tecnologia do DNA Recombinante:
Manipulação Genética Escolha dos vetores para transformação de plantas Cassete de expressão: promotor sequência codificadora sinal de poliadenilação (terminador) O cassete é agrupado em um vetor adequado: genes de interesse a serem introduzidos genes marcadores para transformação e seleção. origem de replicação. gene de resistência a antibióticos em bactérias.
Gene marcador
Gene para resistência bacteriana
Gene para seleção de células transformadas
Promotores Constitutivos •Promotor 35S do vírus do mosaico da couve-flor (35S CaMV) •Ubiquitina Órgão/Tecido-específico •β-Conglicina semente-específico, é a proteína mais abundante da semente da soja. •Rubisco tecido clorofilado. •Patatin tubérculos de batata. Peptídeo sinal •Peptídeo sinal da subunidade β-Conglicina direciona para os corpos protéicos ou
protein storage vacuoles (PSV). •Peptídeo sinal da esporamina para PSV •Peptídeo sinal + propeptídeo da esporamina vacúolo •KDEL retenção no RE
Genes marcadores de seleção Antibióticos •Gene neo canamicina, neomicina e gentamicina •Gene hpt higromicina Herbicidas •Gene arolA glifosato •Gene bar fosfinotricina Genes repórteres 1ª geração •Gene nos e ocs isolado de T-DNA de Agrobacterium, nopalina e octopina •Gene lacZ β-galactosidade •Gene cat clorafenicol acetiltransferase (CAT) •Gene neo NPTII 2ª geração •Gene luc luciferase •Gene uidA β-glucuronidase (GUS) •Gene gfp GFP
Cortes transversais de pecíolo de folha de tabaco transgênico contendo gene GUS sob controle do promotor do gene da PAL de
Arabidopsis
Manipulação Genética Fusão de Protoplastos Isolamento dos Protoplastos: esterilização da superfície de uma folha lavagem da folha em uma solução osmótica retirar a epiderme abaxial ou cortar o tecido para facilitar a penetração da enzima tratamento com a mistura enzimática Purificação do protoplasto isolado Transferir o protoplasto para um meio apropriado. A carga negativa da superfície do protoplasto geralmente faz com que eles sejam repelidos um dos outros. Mecânica - pressão Agentes fusigênicos (íons cálcio, polietilenoglicol, NaNO5, gelatina, concA, glicerol, etc) Pulso elétrico Imunológica - Hartman el al (1973) Antisoro para extratos vegetais (coelho) aglutinação e fusão de protoplastos de Bromusi, Glycine max e Vicia faba) elétrica Eletroporação Aplicação de corrente alternada / alta frequência – alinhamento dos protoplastos e formação de dipolos elétricos. Aplicação de pulsos de corrente contínua / alta tensão – rearranjo das membranas.
Laser – Li et. al. (1999) – fusão de protoplastos de tabaco.
Fusion of Protoplasts in an Electric Field (electrofusion; H.-U. KOOP, H.-G. SCHWEIGER, 1985)
Produtos da fusão de protoplastos: protoplastos não fundidos
Sincárion célula com núcleos não
heterocarion
idênticos fundidos.
homocarion
Cíbrido ou heteroplasto geralmente um núcleo do homocarion desaparece, permanecendo somente o citoplasma dos protoplastos parentais unidos.
Seleção dos híbridos somáticos visual Características morfológicas diferentes Marcação fluorescente
Micromanipulação Citômetro de fluxo Condições de cultura diferenciados
Fig. - Cytology of somatic hybrids between B. napus and O. violaceus and progenies. DAPI (first) and merged (second) images of each cell from GISH analysis were shown. The arrows show the signals from the O. violaceus probe.
Lipossomos
Transformação de plantas via biolística Micropartículas (ouro ou tungstênio) de 0,2 a 0,4 µm de diâmetro Velocidade superior a 1.500km/h
Esquema Esquema básico do diagrama de funcionamento do acelerador de micropartículas que utiliza gás hélio a alta pressão.
Transformação de plantas via Agrobacterium As Agrobactérias Tipicamente do solo, aeróbicas e Gram-negativas. Pertencem à família Rhizobiaceae O gênero Agrobacterium está subdividido em cinco espécies: A. tumefasciens A. rhizogenes A. rubi (Rubus spp) A. vitis (videiras) A. radiobacter (saprófita) Podem ser divididas em três biovares:
O plasmídeo Ti:
Indução do sistema de virulência Reconhecimento e fixação da bactéria no tecido vegetal.
Os genes envolvidos na interação agrobactéria-célula vegetal estão localizados no cromossomo da agrobactéria e incluem chvA, chvB, pscA (ou exoC), att, ahvD, chvE,
miaA, ros, chvG, chvI e avcB.
A região vir do plasmídeo Ti é formada por um conjunto de seis a mais operons (regulon vir), contendo, aproximadamente 34 genes no total. Os operons da região vir são regulados pelas proteínas VirA e VirG.
Oncogenes iaaM e iaaH via alternativa de biossíntese de auxinas. ipt codifica uma isopentenil-transferase que catalisa a primeira etapa de biossíntese de precursores de citocinina.
Preparação de uma linhagem de Agrobacterium para ser usada como vetor para a transformação de plantas. 1. Obtenção de linhagens desarmadas As únicas regiões do T-DNA essenciais para a sua transferência são as sequências de 25pb localizadas em suas extremidades. A região vir, do plasmídeo Ti, também é essencial para a transferência. Figura – Obtenção de um plasmídeo Ti desarmado. Um plasmídeo contendo regiões de homologia com o T-DNA, no caso o pBR322 (pRB), é introduzido em
Agrobacterium (A). Por meio de uma dupla recombinação, o plasmídeo pBR322 se integra ao plasmídeo Ti causando uma deleção (B). O plasmídeo pBR322 não se replica em Agrobacterium, e apenas os recombinantes são selecionados pela resistência à ampicilina. A região deletada contém oncogenes e também não se mantém em Agrobacterium, pois não apresenta origem de replicação (C).
2. Preparação de um vetor contendo o T-DNA com os genes de interesse. Plasmídeo Ti aproximadamente 200 kb Tipos de vetores: Binário Co-integrado
Figura – Sistemas de vetores para a transformação em Agrobacterium. (A) Sistemas co-integrado: o vetor intermediário integra-se ao plasmídeo Ti por um processo de recombinação simples. O vetor intermediário não se replica em
Agrobacterium e apenas os recombinantes são selecionados. (B) Sistema binário: o vetor binário se mantém em Agrobacterium de forma independente do plasmídeo Ti.
Métodos para a transferência de vetores de transformação para Agrobacterium 1. Conjugação Figura – Transferência de um vetor para Agrobacterium por conjugação triparental. O plasmídeo helper (pRK2013) passa para a linhagem de E. coli doadora (A e B) e, a seguir, para a Agrobacterium, promovendo também a transferência do vetor binário (C). O plasmídeo helper não se replica em Agrobacterium e é eliminado (D). O vetor binário se mantém de forma independente do plasmídeo Ti desarmado (E).
2. Eletroporação
3. Choque térmico
Transformação de plantas com linhagens desarmadas de Agrobacterium 1. Co-cultivo
Disco foliar
Explante inicial (foliar)
Co-cultura com a bactéria desarmada em meio líquido
Co-cultura em meio sólido sem antibióticos
Planta transgênica aclimatada em casa de vegetação.
Meio de enraizamento com ou sem agente de seleção.
Meio de indução de brotos com antibiótico e agente de seleção.
2. Floral dip (Arabidopsis)
Figura – (a) o estágio ideal para o Floral Dip, plantas saldáveis com 20 a 30 inflorescências e algumas silíquas maduras. (b) Plantas invertidas com sua porção aérea imersa em uma suspensão de
Agrobacterium por 10s. (c) As plantas são mantidas embrulhadas em um filme plástico para manter a umidade por 16 a 24h. (d) Após a remoção do plástico a planta é mantida em câmara de crescimento por 1 mês. (e) As sementes são coletadas. (f) A seleção dos transformantes primários é realizada em meio de seleção.
Transformação de plantas utilizando Agrobacterium rhizogenes
Genes rol rolA provavelmente um membro da família de proteínas ligantes de DNA. rolB mais eficiente na produção de raízes. Plantas transformadas com rolB apresentam um estado hiperauxínico. Indutor mais poderoso do metabolismo secundário e também supressor do crescimento celular. rolC provê o sinal que ativa o metabolismo secundário. rolD codifica a enzima ornitina ciclodesaminase (OCD), que converte ornitina em prolina. Existem evidências que a prolina atue como um indutor da floração. Alguns trabalhos sugerem que rolA e rolB são glucosidases que liberam auxinas e citocininas, respectivamente, da sua forma ligada.
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gene bacteriano barnase ⇒ ativado apenas nas células produtoras de pólen, bloqueando a produção de pólen ao quebrar o RNA.
... podem aumentar a resistência à antibióticos? ... Podem causar o surgimento de superpragas? OMS, FAO e o OIE têm elaborado estratégias para avaliar riscos e incluir ações de controle e de prevenção: • vigilância dos casos, em pessoas e animais, de resistência aos antibióticos; • a proibição do acréscimo de antibióticos em gêneros alimentícios como rações para animais. EFSA (European Food Safety Authority) Grupo 1: neomicina e canamicina: Amplamente distribuídos entre as bactérias do solo e entéricas. Não são de grande relevância no tratamento de enfermidades humanas São usadas com restrição na veterinária. São utilizados há mais de 13 anos no desenvolvimento de plantas transgênicas sem nenhum relato de problemas de biossegurança. Higromicina: não é utilizado na antibioticoterapia humana. Grupo 2: cloranfenicol, ampicilina, estreptomicina e espectinomicina: Presentes em microorganismos dispersos no ambiente São usados como terapêutica em áreas definidas da medicina humana e veterinária Utilizados somente para testes de campo e não devem ser usados em plantas que irão chegar ao mercado. Grupo 3: amicacina e tetraciclina: Altamente relevantes e de fundamental importância no tratamento de patologias em homens e animais. Devem ser evitados no genoma de plantas transgênicas, e as que os contém não podem ser testadas em campo e NUNCA deverão chegar ao mercado.
Gene de E. coli pmi codifica a proteína fosfomanose isomerase. Manose é tóxico para as células vegetais que o converte em manose-6-fosfato, um inibidor da glicólise. O sistema de seleção PMI/manose é baseado na habilidade das células transformadas de converter a manose-6-fosfato em frutose-6-fosfato, uma vez que possuem a enzima fosfomanose isomerase,
... podem causar alergias? introdução de alérgenos modificação do nível ou natureza de alergénos intrínsicos. ALERGIAS O potencial de alergenicidade de uma proteína não é um parâmetro facilmente previsível
FAO e OMS (2001) • Fonte do gene • Homologia da sequência com alergénos conhecidos • Reações de associação de IgEs de fontes sorológica de indivíduos alérgicos • Propriedades fisico-quiímicas da proteína codificada pelo gene introduzido A fonte da proteína é alergênica? SIM
NÃO
É homóloga a algum alérgeno conhecido?
É homóloga a algum alérgeno conhecido? SIM
NÃO Varredura sorológica específica
SIM
SIM
NÃO
NÃO Varredura sorológica NÃO Ensaios com animais: resistência a pepsina NÃO
A proteína pode ser alergênica Potencial de Alergenicidade
