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Meio de Cultura Os meios de cultura (meio nutritivo) se baseiam nas exigências das plantas quanto aos nutrientes minerais, com algumas modificações para atender às necessidades específicas in vitro.
Meios quimicamente definidos Nutrientes essenciais: Sais inorgânicos (macronutrientes e micronutrientes) Carboidratos Vitaminas Reguladores de crescimento (fito-hormônios)
Componentes de Meios Nutritivos Água Destilada, deionizada ou bi-destilada Macronutrientes São incluídos na forma de sais inorgânicos. Nitrogênio e enxofre podem ser adicionados como componentes de suplementos orgânicos. Nitrogênio Nitrogênio: cátion (amônio) e ânion (nitrito e nitrato) • Nitrato sustenta boa taxa de crescimento em muitas espécies (cenoura, fumo, etc.) existem espécies que não crescem bem (arroz)
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Nitrogênio: fornecido somente na forma de sais inorgânicos de amônio
Sintomas de toxidez Nitrogênio: amônio e nitrato. • a razão entre as concentrações parece ser o fator determinante do crescimento •O amônio deve ser 1/3 do nitrogênio total. Nitrogênio orgânico: aminoácidos • vias biossintéticas reguladas por feedback Fósforo Absorvido pelas plantas na forma do íon H2PO4Em algumas culturas utiliza-se a complementação com fosfato de sódio monobásico. Fontes orgânicas: fitato de sódio, glicose-6-fosfato, frutose-6-fosfato e adenosina menor crescimento em células de cenoura.
Potássio Entra como íon acompanhante do nitrato, fosfato ou cloreto. Exerce funções metabólicas e bioquímicas como íon livre.
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Cálcio Depende da transpiração da planta para o seu transporte no xilema. A alta umidade da cultura in vitro pode levar a deficiência de cálcio em partes aéreas em micropropagação. Magnésio Importante componente das vias metabólicas que utilizam ATP, mesmo em tecidos de caules e raízes que não sintetizam clorofila. Interações entre componentes do meio: antagonismo entre magnésio e cálcio. Adicionado na forma de sulfato de magnésio. Enxofre Entra como íon acompanhante dos micronutrientes zinco e manganês e, na forma orgânica nos aminoácidos cisteína e metionina.
Ferro Faixa intermediária entre micro e macronutrientes Único elemento mineral essencial que não é absorvido como íon livre do meio. A forma mais utilizada é a de quelato de ferro com EDTA (etilenodiamino tetra-acetato)
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Micronutrientes Elementos minerais aceitos como essenciais para plantas clorofiladas (manganês, zinco, boro, cobre, cloro e molibdênio), além do cobalto e iodo. Cobalto Essencial para as bactérias fixadoras de nitrogênio. No meio nutritivo (com nitrogênio fixado) não há necessidade de cobalto. Carboidratos As cultura in vitro não fornecem condições adequadas de iluminação e concentração de CO2. A sacarose é o carboidrato mais utilizado nos meios nutritivos. Vitaminas Os primeiros estudos de cultura de raízes definiram a mistura básica de vitaminas utilizada até hoje. •Tiamina (vitamina B1) •Ácido nicotínico (niacina) •Piridoxina (vitamina B6) Tiamina Na forma de tiamina-pirofosfato é um co-fator essencial para reações da respiração aeróbica, da fotossíntese e biossíntese de alguns aminoácidos e terpenóides em plantas.
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Piridoxina Está envolvida na biossíntese de aminoácidos durante a fotorrespiração, na transaminação de aminoácidos aromáticos que forma a auxina AIA endógena, e na biossíntese de alcalóides.
Ácido nicotínico Substrato da biossíntese de alcalóides. Mio-inositol Tem efeito estimulador no crescimento de calo de fumo. O inositol é incorporado às moléculas de fosfolipídeos que compõem a estrutura da membrana plasmática. Pode ser conjugado com auxinas formando a auxina-inositol, que é inativo como regulador de crescimento. Foi implicado na síntese de paredes celulares em células cultivadas e em protoplastos. Em plantas, o inositol deve ser sintetizado pela ciclização da glicose, mas pode ser limitado in vitro.
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Reguladores de crescimento ou fito-hormônios Yeoman (1970) considerou que o crescimento de calo em diferentes espécies pode ser: 1.
Independente de auxina e citocinina
2.
Dependente de citocinina
3.
Dependente de auxina
4.
Dependente de auxina e citocinina
A formação de raiz, parte aérea e calo em cultura de tecidos é regulada pela disponibilidade e interação de auxina e citocinina. Os reguladores de crescimento ou fito-hormônios agrupam-se tradicionalmente em cinco grupos: •Auxinas •Citocininas •Giberelinas •Etileno •Ácido abscísico
Auxinas 1.
são ativas em quantidades muito pequenas e, quando aplicadas em quantidades muito elevadas, podem matar o vegetal.
2.
como são transportadas da copa para as base, as auxinas tendem a se concentrar nas raízes, onde se acumulam em ligeiro excesso e retardam o crescimento. No caule, ao contrário, sempre há menos hormônio do que o ideal para o crescimento. É por isso que um ligeiro acréscimo de auxina retarda o crescimento das raízes e acelera o do caule.
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3.
as auxinas produzidas pelo óvulo fecundado provocam a transformação das paredes do ovário no fruto. É por isso que se impedirmos a fecundação do óvulo e aplicarmos uma pequena quantidade de auxina nas paredes do ovário, obteremos frutos partenogenéticos, sem sementes.
4.
as auxinas provocam as curvaturas dos vegetais causadas pela gravidade(geotropismo) e pela luz (fototropismo).
5.
os brotos que ficam na extremidade superior dos caules e dos ramos produzem auxinas que, ao descerem ao longo do caule, inibem o desenvolvimento da maioria das gemas laterais(dominância apical), impedindo que se desenvolvam formando ramos.
6.
os frutos e as folhas possuem a camada de abscisão, pela qual caem. Esta camada não se forma enquanto o fruto e a folha são verdes e produzem auxinas. Ao amadurecerem os frutos e as folhas a auxina deixa de ser produzida e a camada de abscisão se forma e provoca a sua queda.
7.
em doses relativamente pequenas as auxinas provocam o enraizamento de estacas, sendo, por isso, muito úteis na reprodução assexuada dos vegetais.
8.
associadas a outros produtos, as auxinas são usadas na cultura de células e tecidos vegetais, fazendo com que haja, não apenas divisão celular, como diferenciação. Este processo, denominado de "micropropagação", permite que se faça, a partir de algumas células a clonagem de indivíduos. •Meio de cultura 7
Citocininas Responsável pelas divisões celulares. Nas folhas regula o metabolismo,nos frutos estimula a divisão celular e o crescimento. Giberelinas
Grupo de hormônios descoberto por cientistas japoneses, que têm atuação complementar à das auxinas. Seus principais efeitos são:
1.
acentuada elongação de caules e ramos, principalmente de plantas anãs, que passam a crescer até o tamanho que seria o normal da espécie.
2.
provocam a quebra da dormência e aceleram a germinação de muitas sementes.
3.
fazem com que as plantas que só florescem quando os dias são longos floresçam mesmo com dias de duração mais curta.
4.
provocam a formação de frutos partenocárpicos com a mesma eficiência que as auxinas.
Etileno Tem um efeito importante acelerando o amadurecimento dos frutos e controlando, também a sua queda e envelhecimento (senescência). Os frutos ao iniciarem o amadurecimento começam a produzir o etileno, o que faz com que o processo se acelere.
Ácido abscísico O Ácido abscísico é uma hormônio vegetal que tem como função a regulação de vários aspectos ligados à fisiologia das plantas, tais como respostas ao estresse hídrico, estímulo da abscisão, inibição da germinação de sementes e o desenvolvimento dos gomos. Responsável pela dormência das gemas do caule.
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Outros aditivos Antibióticos Fungicidas Carvão ativado Ágar e semelhantes Culturas líquidas ou sólidas Culturas líquidas Rápido preparo Maio homogeneidade Utiliza como suporte “pontes” de papel de filtro ou fibras de celulose. Meios sólidos ou semi-sólidos Ágar Ágar polissacarídeo extraído de algas marinhas. O ágar é dissolvido em água fervente e solidificado na presença de cátions quando esfriado. Se o ágar for autoclavado em um pH abaixo de 4,5 ocorre uma hidrólise do ágar. A consistência do meio depende da concentração de ágar utilizada, do pH, da concentração de sais e da presença de certas substâncias.
Outros gelificantes: Amido Polissacarídeos de ácido glucurônico, ramnose e glicose (gel-gro, gelrite ou phyta-gel) •Meio de cultura 10
O pH e outras características do meio Normalmente ajustado com HCl ou NaOH para um valor entre 5 e 6. O pH influi na utilização de amônio como fonte nitrogênio. Durante o crescimento das células, o pH do meio se altera à medida que diferentes íons são absorvidos pelas células e os produtos metabólicos excretados para o meio. A capacidade tamponante do meio nutritivo é baixa. O processo de autoclavagem altera o pH de meios nutritivos. Durante a estocagem há tendência de acidificação dos meios (dissolução do CO2)
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Preparação dos Meios
Esterilização Autoclavagem a 121oC por 15 a 20 min. Algumas substâncias orgânicas são degradadas por calor (glutamina, ácido giberélico, tiamina e o ácido abscísico) Pode ocorrer a “caramelização” e a hidrólise de sacarose.
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